Ryanodine受体蛋白的分子结构和理化性质分析

杨 越， 朱家佳， 唐 乖， 龙鼎新

(南华大学 公共卫生学院， 衡阳 421001)

钙离子(Calcium，Ca2+)是广泛存在于细胞内的第二信使，其参与调节机体内细胞增殖、分化、细胞自噬与细胞凋亡等各种生理过程[1]。目前，已知最大的钙离子释放通道蛋白Ryanodine受体(Ryanodine receptor, RyR)是以植物生物碱Ryanodine命名的[2]。RyR是从肌浆网/内质网的细胞内贮存中释放钙的一种离子通道[3-4]。该通道位于肌肉、神经元和许多其他类型细胞的内质网上。已知的RyR有3种亚型(RyR1、RyR2、RyR3)，RyR1主要在骨骼肌中表达，RyR2在心肌中高水平表达，而RyR3在不同组织中普遍表达，但在脑和膈膜中相对丰富[5]。并且RyR调节的细胞内钙离子浓度变化是一系列生物过程的基础[6]。异常RyR介导的Ca2+释放已经与恶性高热[7]、心力衰竭[8]和神经变性疾病[9]等几种疾病密切相关[10]。

细胞含有多种与RyR相互作用的蛋白质分子，并可以对其活性产生调节作用。因此，RyR 在许多信号通路中均有重要作用，虽然目前已展开对于此类大分子晶体的研究，但对于其详细的结构信息分析目前还没有研究者对其进行整合。因此本文拟基于生物信息学方法，首次对人RyR蛋白结构及理化性质等进行分析整理，为RyR的机制研究及生物学实验等提供重要的参考依据，帮助研究人员找到调查基因以及蛋白质的线索。

1 材料与方法

在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载人RyR序列；使用ProtParam程序[11](http://web.expasy.org/protparam)预测RyR 3种亚型蛋白的理化性质；利用Protscale程序[11](http://web.expasy.org/protscale)进行疏水性分析；使用ExPASy-GOR IV(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)进行二级结构预测；使用SignalP4.1Server[12](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析信号肽切割；使用ProtComp 9.0在线(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)进行亚细胞定位预测；使用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)进行蛋白跨膜结构预测；使用NetPhos 2.0 Server[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)分析蛋白信息；使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)进行同源搜索，并利用ClustalX[14]软件进行多序列比对分析，随后使用MEGA5[15]软件构建系统进化树；使用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析蛋白质-蛋白质相互作用。

2 结果与分析

2.1 人RyR蛋白序列的查找

根据文献报道，已有3种人RyR亚型被确认，其NCBI序列号分别为: AAA60294、NP_001026、CAA04798。按序列号搜索NCBI数据库获得它们的氨基酸序列，并将其分别命名为RyR1、RyR2和RyR3。

2.2 RyR理化性质分析

使用ProtParam分析RyR 3种亚型理化性质、分子式、分子量和等电点等，结果详见表1。

随后利用Protscale对RyR蛋白进行疏水性和亲水性分析，如表2及图1所示。结果进一步表明，3种RyR蛋白均为亲水性蛋白。

图1 RyR蛋白疏水性/亲水性预测

表1 RyR蛋白理化性质

表2 RyR蛋白亲水性与疏水性氨基酸残基位置

2.3 蛋白质二级结构分析

主要多肽链的空间原子的排列决定蛋白质的二级结构。使用GOR IV二级结构预测模块计算RyR二级结构，并绘制结构模型(表3及图2)。 结果显示RyR蛋白含有大量α-螺旋及无规则卷曲，约占85%，推测其为RyR主要的二级结构原件。

表3 RyR蛋白二级结构特征

图中A、B、C的上部为示意图；下部为高峰数字。蓝色：α-螺旋；红色：延伸链；紫色：不规则的卷曲结构

图2RyR蛋白二级结构分析

Figure 2 Secondary structure analysis of RyR proteins

2.4 信号肽切割位点预测

使用SignalP-4.1来预测RyR蛋白信号肽及切割位点。结果显示，RyR蛋白没有信号肽位点，属于非分泌性蛋白(表4)。

2.5 亚细胞定位预测

使用ProtComp 9.0软件在线预测RyR蛋白亚细胞定位，提示其可能定位于内质网上(表5)。

2.6 蛋白跨膜结构预测

使用TMHMM在线软件进行RyR蛋白跨膜结构分析，结果如图3所示，RyR蛋白均为跨膜蛋白。

表4 RyR蛋白质信号肽切割位点预测

注：Max. C表示原始切割位点评分最大值；Max. Y表示合并的切割位点评分最大值；Max. S表示信号肽评分最大值；Mean S表示可能的信号肽的平均S值；D表示平均值S和Y分数最大值的加权平均值，用于区分是否为信号肽的分数

表5 RyR蛋白亚细胞定位预测

2.7 磷酸化位点分析

使用NetPhos 2.0 Server Online预测RyR蛋白磷酸化位点，结果见表6。结果为可能的蛋白激酶磷酸化位点分布。

表6 RyR蛋白磷酸化位点

2.8 RyR蛋白信息预测

PredictProtein是欧洲分子生物学实验室提供的蛋白质序列和结构的在线预测网站，可从中获得蛋白质二级结构、二硫键、跨膜螺旋等信息。RyR蛋白结合位点，跨膜结构域和二硫键在线预测结果见图4、图5和图6。预测结果显示RyR蛋白均具有多蛋白结合位点，跨膜结构域与TMHMM预测结果一致，均没有二硫键。RyR蛋白分子功能本体论结果表明：该蛋白具有结合能力，底物特异性跨膜转运蛋白活性，离子通道活性，离子跨膜转运蛋白活性等(表7)。RyR蛋白生物学过程本体结果表明：参与离子运输、单生物体过程及阳离子转运等(表8)。

图3 RyR蛋白跨膜结构预测

图4 RyR蛋白的结合位点预测

2.9 多序列对比和系统进化树构建

利用NCBI 中的BLAST对人RyR蛋白3种亚型序列进行BLASTp 搜索，选择同一性较高的序列，获得与RyR1、RyR2、RyR3同源的31个氨基酸序列，对这些序列与RyR各亚型序列进行多序列对比，RyR 3种亚型与已知不同种属RyR序列分别有95.90%、95.57%和96.79%的序列相似性。随后利用MEGA5进行系统进化树构建，并对其进行聚类分析。系统进化树聚类分析结果(图7)显示，在RyR的3种亚型中，RyR2与RyR3最先聚为一类，随后与RyR1聚为一类。对于不同种属的同源序列之间，RyR的3种亚型均与家兔属亲缘性最近。

图5 RyR蛋白的跨膜结构域预测

图6 RyR蛋白质的二硫键预测

序号RyRGO:IDGO TermReliability%1RyR1GO:0005488结合492RyR1GO:0005515蛋白结合493RyR1GO:0022803被动跨膜转运活性414RyR1GO:0022891底物特异性跨膜转运蛋白活性415RyR1GO:0022892特异性底物转运活性416RyR2GO:0022803被动跨膜转运活性487RyR2GO:0005488结合488RyR2GO:0022891底物特异性跨膜转运蛋白活性489RyR2GO:0022892特异性底物转运活性4810RyR2GO:0015075离子跨膜转运蛋白活性4811RyR3GO:0005488结合4812RyR3GO:0022803被动跨膜转运活性4213RyR3GO:0022891底物特异性跨膜转运蛋白活性4214RyR3GO:0022892特异性底物转运活性4215RyR3GO:0015267通道活性42

表8 RyR生化过程本体论

2.10 蛋白质-蛋白质相互作用分析

使用STRING数据库在线分析RyR的蛋白质互作网络，结果显示RyR蛋白均与FKBP1B、CALM、TRDN等蛋白具有相互作用(图8)。

图7 RyR蛋白与其他物种同源序列的遗传关系

网络节点表示蛋白质，蛋白间的连线表示预测的功能关联。红线：基因融合；绿线：基因相近；蓝线：基因共同产生；紫线：实验证明；黄线：文本挖掘证据；浅蓝线：辅助数据库证据；黑线：基因共同表达

图8RyR蛋白互作网络

Figure 8 The protein-protein interaction network of RyR proteins

3 讨论

Ca2+在生命活动中起着至关重要的作用, 是影响或决定许多细胞反应的独立第二信使[16]。而胞内Ca2+来源于质膜上电压和受体门控通道以及胞内钙释放通道IP3R 和RyR介导的钙释放[17-18]。RyR是一种主要的钙诱导钙释放(Calcium induced calcium release, CICR)通道，位于神经元和大多数细胞类型的内质网膜上[19]。RyR控制细胞内储存的如内质网的Ca2+外流进入细胞质的过程[20]。研究发现，RyR在整个神经系统中都大量存在，并通过CICR控制神经元中的多种进程，包括囊泡释放、膜去极化和凋亡等。RyR含有一个大的胞质结构域，它与蛋白质、小分子和信号分子相互作用，调节由该通道介导的CICR[21]。在神经元中，RyR和L型Ca2+通道之间存在紧密的功能耦合。神经元钙信号在记忆过程中发挥关键作用，RyR介导的钙释放参与了空间记忆过程的获取和整合[22-23]。特别是在大脑中，RyR参与各种功能，如神经元活力、突触可塑性和更高的认知功能，如学习和记忆等[24]。

由于RyR在机体中参与多种调控机制，并且目前对大分子晶体的研究愈发丰富，本文首次对RyR的3种亚型的跨膜结构、理化性质和二级结构等进行分析。结果显示RyR 3种亚型定位于内质网，均具有跨膜结构，预测其整体为亲水性蛋白。有研究报道，RyR蛋白C-末端具有疏水性结构域，并且是跨膜蛋白疏水结构域[25-26]，其跨膜结构域形成离子通道。本文结果中，显示在RyR蛋白的C-末端为离子跨膜结构域并具有较高的疏水性氨基酸残基，且后续蛋白信息预测RyR蛋白具有离子通道活性、参与离子转运等，与前人结果一致。RyR所具有的亮氨酸周期性重复出现形成氨基酸拉链，其形成的α-螺旋与下一个α-螺旋相互作用，在RyR同源四聚体中起重要作用。二级结构预测结果显示3种RyR蛋白均含有大量α-螺旋及无规则卷曲，推测α-螺旋及无规则卷曲是RyR的主要二级结构原件。磷酸化以及去磷酸化是重要的细胞内的传导途径，研究表明RyR过度磷酸化可以增加其对钙离子敏感性，引起钙离子紊乱，与心力衰竭以及心律失常等的发生有着密切关系[27]。因此对磷酸化位点的分析至关重要。磷酸化位点分析发现，RyR 3种亚型都具有Ser、Thr 和Tyr 这3 种磷酸化位点，其中Ser位点较多，因此推测丝氨酸最有可能参与其蛋白磷酸化。近几年也多有文章报道丝氨酸可能为RyR磷酸化的潜在靶点，但不是唯一靶点[28-29]。对RyR不同物种的序列进行同源分析，结果显示不同物种间的序列相似性很高，表明其在进化过程中相对保守，说明其具有重要的功能作用从未得以在进化过程中保留。RyR 3种亚型的聚类分析显示，RyR2与RyR3最先聚为一类，亲缘性较高，随后与RyR1聚为一类。蛋白质不是孤立存在于生物体中的，它们之间的相互作用往往发挥着重要的生物学功能，蛋白互作网络分析有助于从系统的角度研究蛋白之间的相互作用，结果显示RyR蛋白3种亚型均与FKBP1B、CALM、TRDN等蛋白具有相互作用，FKBP1B可与RyR形成复合体从而稳定RyR通道，对其功能进行调节[30-31]。钙离子对RyR活性有重要的影响，CALM可与RyR在胞质装配区形成复合体，对RyR的活性进行双向调节[32-33]。TRDN是心肌和骨骼肌钙释放复合体的一个重要组分，是RyR触发骨骼-心肌收缩的关键步骤[34]。

本文从RyR蛋白序列出发，通过生物信息学分析，为进一步研究RyR调控机制提供了理论基础。然而目前生物信息学分析仍存在着一定的局限性，因此采用多软件多平台的综合分析，能够尽可能降低其预测的局限性，提高预测的准确性。此外，还需根据预测的结果，对蛋白重要功能区域的表达进行一系列后续实验验证，从而判定预测结果的准确性。