竹叶超声提取工艺的优化

张 永， 韩卫丽， 郭 静， 许海良， 张 彤， 丁 越*

（1.上海中医药大学，上海201203；2.无锡市第二人民医院，江苏 无锡214002；3.上海海中实业有限公司，上海201103）

竹叶是一种药食同用的清热解毒中药，因其营养价值丰富及良好的保健作用越来越受到人们重视，常被开发成各种功能性产品［1］，它以清心火兼利尿见长，大多用于治疗热病烦渴等症状，对心血管疾病有很好的防治作用［2］。近年来研究表明，竹叶中含有大量对人体有益的成分，如黄酮及其苷类、多糖类、微量元素等［3-4］，具有较高的生物活性，作为一种廉价无毒的可再生资源，其使用价值有待进一步开发［5］。

黄酮类成分为竹叶中最主要的保健成分，具有抗氧化、防治心脑血管疾病［6-7］等功效，以荭草苷、异荭草苷、异牡荆素、牡荆素等碳苷黄酮为代表［8-9］，该类成分亲水性强，有相对稳定的结构，有利于开发成保健产品［10］。本实验以提取时间、乙醇体积分数、料液比为影响因素，荭草苷、异荭草苷总含有量为评价指标，通过HPLC 指纹图谱结合正交试验优化竹叶提取工艺，以期为其开发利用提供参考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪 （美国Agilent 公司）；SB-3200D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BSA124S 分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；TG18W 台式高速离心机（博科集团）。荭草苷、异荭草苷对照品（安徽西青果生物科技公司，批号238011-201712、238016-201712）。竹叶（产地浙江长兴煤山镇，批号17032401，编号S1～S9） 经专家鉴定为禾本科植物毛竹Phyllostachys pubescens 的干燥叶子。乙腈为色谱纯（美国Sigma 公司）；甲酸为色谱纯（上海安谱实验科技有限公司，批号NC300330）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取荭草苷、异荭草苷对照品适量，加甲醇分别制成含两者0.112 4、0.248 7 g／L 的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备 精密称取药材粉末1.0 g，置于50 mL锥形瓶中，25 mL 80%乙醇超声30 min，加水稀释1 倍，15 000 r／min 离心10 min，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱 （4.6 mm×250 nm，5 μm）；流动相水（含0.025%甲酸） -乙腈，梯度洗脱，程序见表1；检测波长350 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；进样量10 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 线性关系考察 将荭草苷、异荭草苷对照品溶液逐级稀释成相应质量浓度，在“2.3.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程分别为Y ＝25 967X ＋0.645（r＝0.999 9）、Y ＝30 701X＋6.155（r ＝1.000 0），分别在0.9～112.4、1.9～248.7 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

2.3.3.1 日内精密度 精密吸取对照品溶液，同1 d 内在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得荭草苷、异荭草苷峰面积RSD 均小于0.9%，表明日内精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3.3.2 日间精密度 精密吸取对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6 d，每天1 次，测得荭草苷、异荭草苷峰面积RSD 均小于3.1%，表明日间精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，同1 d 内于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得荭草苷、异荭草苷峰面积RSD 分别为1.2%、2.5%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批药材粉末6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得荭草苷、异荭草苷含有量RSD 分别为2.0%、2.1%，表明本该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取含有量已知的药材粉末0.5 g，精密加入低、中、高质量浓度对照品溶液，每批3 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，红草苷、异荭草苷平均加样回收率分别为102.1%、 98.2%， RSD 分别为2.0%、2.4%。

2.4 HPLC 指纹图谱建立 将提取液色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 2.0 版，以平均数方法生成对照图谱，结果见图2，可知共有14 个共有峰，与对照品色谱图比对后共指认出4 个（2、7、8、9 号），分别为绿原酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素，其中异荭草苷色谱峰时间适中，对称性良好，故选择其作为参照峰（R）。

然后，测定相似度，结果见表2。由表可知，14 个共有峰的峰面积均大于98%，相似度均大于0.99，表明提取液化学成分相似。

2.5 主成分分析［11-13］将14 个共有峰导入SPSS 软件，提取特征值λ＞1 的主成分1 个，方差贡献率为89.7%，可表达指纹图谱信息的89.7%，代表性良好。第一主成分中变量权重值最大的色谱峰分别为7 号（荭草苷）、8 号（异荭草苷），权重系数分别为0.997、0.999，表明两者占决定性作用。因此，本试验选择这2 种成分总含有量作为评价指标，正交试验优化提取工艺。

图2 竹叶HPLC 指纹图谱

表2 相似度测定结果

2.6 单因素试验

2.6.1 乙醇体积分数 精密称取药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，按料液比1 ∶25 提取30 min，考察40%、60%、80%、100%乙醇对提取效果的影响。结果，80%乙醇提取时荭草苷、异荭草苷总含有量最高，故选择其作为提取溶剂。

2.6.2 提取时间 精密称取药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，按料液比1 ∶25 加入80%乙醇，考察提取时间10、20、30、60、90 min 对提取效果的影响。结果，荭草苷、异荭草苷总含有量随着提取时间延长而升高，但30 min 后增长趋势渐缓，而且此时提取率约为提取60 min 时的95%以上。从节约能源、提高效率的角度考虑，提取时间不宜过长，故选择30 min 作为提取时间。

2.6.3 料液比 精密称取药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，加入80%乙醇提取30 min，考察料液比1 ∶10、1 ∶25、1 ∶50 对提取效果的影响。结果，随着料液比增加提取效率逐渐升高，但在1 ∶25 时荭草苷、异荭草苷大多已溶出，提取率基本趋于稳定。从节约溶剂和节能的角度考虑，溶剂用量不宜过大，故选择1 ∶25 作为料液比。

2.7 正交试验 在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、料液比（C） 作为影响因素，设计L9（34） 正交试验。因素水平见表3，结果见表4，方差分析见表5。

表3 因素水平

表4 试验设计及结果

表5 方差分析

由表3 可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B＞A＞C，即乙醇体积分数＞提取时间＞料液比；由表4 可知，因素A、B 有显著影响（P＜0.05），而因素C 无显著影响（P＞0.05）。最优工艺为A3B2C3，即提取时间30 min，乙醇体积分数80%，料液比1 ∶50，但料液比过大会造成能源和溶剂的浪费，故本实验选择A3B2C2，即提取时间30 min，乙醇体积分数80%，料液比1 ∶25。再进行3 批验证实验，测得荭草苷、异荭草苷总含有量为1.78 mg／g，高于表3 最高值1.65 mg／g，表明工艺稳定可行。

3 讨论与结论

本实验建立竹叶超声提取液的HPLC 指纹图谱，确认了14 个共有峰，并鉴定出其中4 个，分别为绿原酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素，而且各批样品相似度无明显差异，表明其所含化学成分相似，但相对峰面积差异大，可能与提取时间、乙醇体积分数、料液比、超声功率等因素有关。由于共有峰数据较多，其权重无法确定，故本实验又通过主成分分析提取了竹叶超声提取液中起决定性作用的黄酮苷类成分——荭草苷和异荭草苷，为进一步优化超声提取工艺奠定了基础。

正交试验结果表明，影响竹叶中有效成分提取率的因素依次为乙醇体积分数＞提取时间＞料液比，其中乙醇体积分数、提取时间有显著影响（P＜0.05）。最佳条件为提取时间30 min，乙醇体积分数80%、料液比1 ∶25，荭草苷、异荭草苷总含有量为1.78 mg／g，RSD 为2.9%，表明工艺稳定可行。