不同产地大高良姜、红豆蔻HPLC 指纹图谱

丘海冰， 秦华珍， 谢 鹏， 苏善美， 柳俊辉， 尹 优， 陈俊其， 李明芳

（广西中医药大学，广西 南宁530200）

大高良姜为姜科山姜属植物大高良姜Alpinia galanga Willd.的干燥根茎，红豆蔻为其干燥成熟果实，即大高良姜、红豆蔻为同基原的不同药用部位。2 味中药都具有温胃散寒的功效，均用于治疗胃脘冷痛。且都收载于《中华本草》［1］，同时，红豆蔻也被收载于2015 年版《中国药典》［2］。课题组前期研究显示大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位均具有治疗胃溃疡寒证的作用，其作用机制相似，均与抑制炎症因子表达、降低氧自由基反应，抑制胃肠运动、减少胃酸分泌有关［3］。中药的亲缘关系、药用部位、化学成分、药性药效之间存在密切关系，亲缘关系相同或相近的药物往往具有相同或者相似的化学成分，这些成分可能是支撑其药性药效的物质基础［4］。为了解亲缘关系与化学成分之间的关系，探讨大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位具抗胃溃疡寒证作用的物质基础。基于前药效筛选，确定乙酸乙酯部位为其药效部位［5］， 本研究采用HPLC 法建立不同产地大高良姜、红豆蔻的指纹图谱，并通过相似性分析、 聚类分析、 主成分分析［6-10］对大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位的化学成分进行模式识别，深入分析其共有峰，进行基于药效的指纹图谱研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SQP 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；TGL-16G 超声波清洗器（上海安亭科学仪器厂）；L600 台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 试剂 乙醇（20170413，分析纯，成都市科隆 化 学 品 有 限 公 司）； 石 油 醚、 乙 酸 乙 酯（20171201、20180226，分析纯，天津市富宇精细化 工 有 限 公 司）； 甲 醇、 乙 腈 ［20171201、20180118，色谱纯，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司］；冰乙酸（20160912，色谱纯，天津市光复科技发展有限公司）；原儿茶酸（110809-201205，含有量≥99.9%）、原儿茶醛（110810-201608，含有量≥99.9%）、 香 草 酸 （110776-201503， 含 有 量≥99.8%）、芦丁（100080-201610，含有量≥91.9%），均购于中国食品药品检定研究院；对羟基苯甲酸（ST05300120MG，含有量≥99.2%）、对羟基苯甲醛（DST180402-710， 含 有 量≥99.0%）、 短 叶 松 素（ST37410105MG，含有量≥99.4%），均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.3 药材 大高良姜、红豆蔻为姜科山姜属植物大高良姜Alpinia galanga Willd.的干燥根茎和果实，购自广西南宁、玉林、北海等10 个不同产地，信息见表1。经广西中医药大学中药鉴定教研室田慧教授鉴定均为正品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液 分别精密称取200 g 大高良姜、红豆蔻药材粉碎成粗粉，加8 倍量85%乙醇回流提取3 次，每次2 h，过滤，收集滤液，合并3次滤液，低温挥去乙醇，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位， 浓缩至褐色浸膏， 收率分别为3.08%、7.93%，分装保存于4 ℃冰箱备用。精密称取50 mg 干膏，置于2 mL 量瓶中，加甲醇溶解并 定 容， 超 声10 min， 离 心， 取 上 清 液， 经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 对照品溶液 称取对照品原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、香草酸、芦丁、对羟基苯甲醛、短叶松素适量，置于2 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容， 超声10 min， 离心， 取上清液， 经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件 Inertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.05%冰乙酸水（B），梯度洗脱（0 ～20 min，20%～25%A；20～27 min，25%～30%A；27～37 min，30%～40%A；37～65 min，40%～45%A）；检测波长270 nm；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL／min；进样量10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液， 在“2.2” 项色谱条件下连续进样6 次，测得大高良姜、红豆蔻各主要色谱峰相对保留时间RSD 分别为0.063 2%～0.137 0%、0.074 7%～0.713 8%，相对峰面积RSD 分别为0.165 6%～2.105 7%、0.372 8%～2.769 2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在“2.2” 项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得大高良姜、红豆蔻各主要色谱峰相对保留时间RSD 分别为0.138 1%～0.362 8%、0.106 0%～0.694 2%，相对峰面积RSD 分别为0.245 9%～2.095 7%、0.196 6%～2.470 1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品6 份， 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样，测得大高良姜、红豆蔻各主要色谱峰相对保留时间RSD 分别为0.034 8% ～0.458 2%、0.071 8%～0.262 2%， 相对峰面积RSD 分别为0.124 7%～1.972 0%、0.162 5%～2.197 2%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱建立 按“2.1.1” 项下方法分别制备10 批不同产地大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样，分别建立不同产地大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位指纹图谱，并将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版） 进行相似度评价，分别以S1 为参照图谱，多点校正后进行谱峰匹配，得到大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位指纹图谱，见图1。并生成大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位共有模式的对照图谱（R），分别标定出17 个共有峰，见图2～3。其中对羟基苯甲醛（6 号峰） 为大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位的主要成分，在10 个产地中均有较好的分离度，且峰形较好、峰面积较大，故选取对羟基苯甲醛作为参比峰，10 批不同产地大高良姜乙酸乙酯部位共有峰相对峰面积0.012 5 ～2.190 4、红豆蔻乙酸乙酯部位共有峰相对峰面积0.013 5 ～1.910 6。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

图2 大高良姜、红豆蔻HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogran of A.galanga and Galangae Fructus

图3 混合对照品溶液色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standaed compounds

2.4.2 相似度分析 将得到的10 批不同产地大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版），计算相似度，两者相似度分别为0.899～0.994、0.882～0.962。

2.5 聚类分析 将10 批不同产地大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位的指纹图谱所得的共有峰峰面积原始数据导入SPSS 24.0 软件，采用组间联接法，Squared Euclidean distance 聚类，得到10×10 阶的近似值矩阵，结果见图4。表明10 批不同产地大高良姜样品分为2 大类，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S9 为一类，S7、S8、S10 为一类；而10批不同产地红豆蔻样品分为2 大类，S1、S10 为一类，S2 ～S9 为一类，结果均与相似度分析结果一致。

图4 10 批样品聚类树状图Fig.4 Dendrograms of ten batches of samples

2.6 主成分分析 将10 批不同产地大高良姜、红豆蔻样品的共有峰峰面积进行标准化处理后，导入SPSS 24.0 软件，进行主成分分析，结果见图5。大高良姜主成分分析结果显示，共提取出2 个主成分，第一主成分的特征值7.490， 方差贡献率74.902%；第二主成分的特征值2.198，方差贡献率21.981%；第三主成分的特征值0.297，方差贡献率2.970%。前2 个主成分的累积方差贡献率已达96.883%。而红豆蔻乙酸乙酯部位主成分分析结果显示，只有前2 个主成分的特征值大于1，即共提取了2 个主成分， 第一主成分的特征值7.790，方差贡献率77.904%；第二主成分的特征值1.366，方差贡献率13.658%；第三主成分的特征值0.541，方差贡献率5.408%。前2 个主成分的累积方差贡献率已达91.562%。

图5 10 批样品主成分分析图Fig.5 PCA plot for ten batches of samples

结果表明大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位的化学成分与产地无明显差异性，其结果与聚类分析结果一致。从因子载荷矩阵结果表可以看出两者第一主成分均具有最大的特征值，故选取第一主成分中各峰的贡献率值对其进行分析，结果见图6，得出大高良姜乙酸乙酯部位前5 个权重值较大，分别为10、17、6、2、16 号峰，表明此5 个峰对大高良姜质量影响较大；同时，分析红豆蔻乙酸乙酯部位各因子的权重值，得前5 个权重值较大，分别为5、16、17、11、6 峰，表明此5 个峰对红豆蔻质量影响较大。

3 讨论

由于中药化学成分的复杂性，结合前期课题实验结果［11］，同时为了比较同基原不同药用部位大高良姜、红豆蔻的亲缘-化学成分关系，本研究重点考察了色谱柱、检测波长、流动相、柱温、体积流量等因素，基于分离度、峰形、出峰数目等，最终选取“2.2” 项下条件。

图6 第一主成分贡献率Fig.6 Contribution rate of the first principal component

对10 批不同产地大高良姜、红豆蔻建立指纹图谱，分别标识17 个共有峰。大高良姜相似度均大于0.899，平均相似度0.967 7，表明不同产地大高良姜乙酸乙酯部位的化学成分相一致，但其含有量存在明显差异。聚类分析结果将10 批不同产地大高良姜分为2 大类，表明不同产地对大高良姜化学成分无明显影响；主成分分析提取出2 个主成分。

10 批不同产地红豆蔻相似度均大于0.882，平均相似度0.944 6，表明不同产地红豆蔻成分极其相似。此外，聚类分析结果将10 批不同产地红豆蔻分为2 大类，表明不同产地红豆蔻质量无明显差异。主成分分析提取出2 个主成分。

共有模式对照图谱表明具有亲缘关系的同基原不同药用部位的大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位所含成分基本一致，其化学成分差异除了化学成分含有量差异外，主要表现在大高良姜峰13 和红豆蔻峰12，这2 个色谱峰可能为其药效差异的主要成分。

早期研究表明，原儿茶酸具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、 抑菌、 镇痛等多方面药理活性［12］。原儿茶醛具有非常广泛的药理活性，包括有抗动脉粥样硬化、保护心机、抗血栓形成、抗氧化等药理作用［13-16］；同时具有抗败血症、抗病毒、抗纤维化等药理活性［17-19］。芦丁具有抑菌、抗炎镇痛作用［20］。对羟基苯甲醛具有显著的抗炎、抗血小板聚集作用［21-22］。这些大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位共有的成分可能为其抗胃溃疡寒证作用的物质基础。而除标识出的7 个物质外，大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位其他共有峰和非共有峰是什么物质，尚未明确。下一步将通过质谱、血清药物化学等手段研究其共有成分和非共有成分对大高良姜、红豆蔻乙酸乙酯部位的质量和药效的影响。