基于网络药理学研究川芎治疗冠心病的作用机制

赵新望， 徐文华， 赵 阳， 伍燕宏， 罗 蔚， 朱梓铭， 郑景辉

（1.广西中医药大学，广西 南宁530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530001）

我国心血管疾病发生率不断升高， 《中国心血管病报告2017》 推算目前患病人数为2.9 亿，其中冠心病1 100 万［1］，2013 年死亡人数较1990 年增加了90.9%［2］。冠心病属于中医“胸痹”“真心痛” “厥心痛”范畴，中药在相关治疗方面有其独到之处，其中川芎有活血行气、祛风止痛功效，其所含成分川芎嗪的作用已得到广泛的认可，但研究发现该药材主要化合物为苯酞类和酚酸类，前者含有量更高，而后者很低很少，甚至在许多样品中无法被检测出来，故川芎嗪无法作为川芎质量评价的指标［3］。

本研究通过网络药理学方法，筛选出川芎主要化合物成分及其发挥作用的相关靶点，挖掘冠心病已知相关靶点，通过生物学信息注释数据库（DAVID）对靶点基因本体（GO）生物过程，以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）中代谢通路进行分析，为该药材治疗冠心病的进一步探索提供参考。

1 材料

TCMSP（中药系统药理学数据库及分析平台，http： ／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）； Pharm-Mapper （反 向 药 效 团 匹 配 数 据 库， http： ／／59.78.98.102／pharmmapper／submit_ file.php）；String（蛋白互作网络数据库，https： ／／string-db.org／cgi／network.pl ）； GeneCards 数 据 库（https： ／／www.genecards.org／）； Venny2.1.0（http： ／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）；Cytoscape3.2.1 软件 （http： ／／cytoscapeweb.cytoscape.org／）；DAVID（基因注释数据库，http： ／／david.nifcrf.gov／）； GraphPad Prism 7.00 软 件（https： ／／www.graphpad.com／）。

2 方法

2.1 川芎中化合物及作用靶点的筛选 依托TCMSP 检索出与川芎相关的所有化合物成分，基于样本量、数据的复杂性及文献报道，根据药代动力学（ADME） 参数确定药物口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18 作为筛选条件，将筛选后得到的化合物成分上传到PharmMapper 服务器，得到其作用靶点。最后，应用String 数据库通过输入靶点名称并限定物种为人，将检索得到的所有靶点校正为其官方名称（official symbol） 后，获取与化合物成分相关的靶点。

2.2 冠心病潜在作用靶点的筛选 通过GeneCards数据库检索与冠心病发病相关的靶点，它可通过Gifts 算法来计算靶点与疾病之间的相关度，并以其进行排序，选择相应靶点。

2.3 靶点相互作用网络图的构建与分析 通过venny2.1.0 软件将川芎成分靶点与冠心病疾病靶点取交集，得到川芎治疗冠心病的潜在作用靶点。然后，由String 数据库得到靶点相互作用网络图。

2.4 作用靶点富集分析网络图的构建 应用David数据库对川芎作用靶点的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC）进行KEGG 通路富集分析，采用Omicshare 软件绘制KEGG 通路富集分析气泡图，以进一步揭示川芎治疗冠心病的作用机制。

2.5 化合物-作用靶点网络图的构建 将川芎化合物和作用靶点导入Cytoscape 软件，构建川芎化合物-靶点网络，预测出川芎治疗冠心病发挥主要作用的靶点与化合物。

3 结果

3.1 化合物及其作用靶点 检索得到川芎化合物有189 个，符合筛选条件的7 个，分别为扁桃醇、杨梅酮、含川哚、洋川芎醌、川芎萘呋内酯、谷甾醇、FA，见表1。然后，将PharmMapper 数据库中所有靶点删除重复的，整合得到川芎作用靶点481个；经GeneCards 数据库检索，整合得到冠心病靶点5 264 个，取相关度大于20 的443 个，通过venny2.1.0 软件取两者交集，韦恩图见图1；川芎、冠心病作用靶点取交集，得到潜在作用靶点31 个，见表2。

表1 川芎关键化合物Tab.1 Key compounds in Chuanxiong Rhizoma

图1 韦恩图Fig.1 Venn diagram

表2 川芎治疗冠心病的关键靶点Tab.2 Key targets for Chuanxiong Rhizoma in treating coronary heart disease

3.2 靶点相互作用网络 由String 数据库得到靶点相互作用网络图（图2），其中“边” 代表作用靶点之间的关联，其粗细用combine score 表示，“边” 越粗，combine score 值越大，代表其结合度越大；节点代表作用靶点。由图可知，共有31 个节点、93 条边，平均节点度为6，平均局部聚类系数为0.605。

图2 川芎靶点蛋白相互作用网络图Fig.2 Protein interaction network of Chuanxiong Rhizoma tragets

3.3 化合物-靶点相互作用网络图 通过Cytoscape

3.5.1 软件构建川芎治疗冠心病化合物-靶点相互作用网络图（图3），体现了川芎治疗冠心病多成分、多靶点协同作用的特点。

图3 化合物-靶点相互作用网络图Fig.3 Compounds-targets interaction network

3.4 靶点的GO 富集分析 利用David 数据库，从生物过程、分子功能、细胞成分3 个水平对31 个关键靶点进行分类分析，分别得到70、16、15 条，P＜0.05 者分别为56、9、9 条。然后，通过Graph-Pad Prism 7 软件将这些条目做成可视化条形图（生物过程条目较多，取排名前10 的条目），见图4。

图4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.5 KEGG 通路富集分析 对川芎作用于冠心病主要的31 个靶点进行KEGG 通路富集分析，得到6 条P＜0.05 者，再通过Omicshare 软件对其进行可视化分析，气泡图见图5。

4 讨论

网络药理学可从分子水平上预测药物治疗疾病的靶点、通路等，近年来得到了越来越广泛地认可和应用，故本研究通过该方法研究川芎治疗冠心病的作用机制，结果得到7 个主要化合物，31 个作用于冠心病的主要靶点，主要涉及凝血、血管生成、血管扩张、炎症反应、抗氧化、血压调节6 个生理病理过程。血管性血友病因子（VWF） 及凝血因子（F2、F5、F11、F13A1） 主要与凝血过程有关，VWF 与血小板结合后可导致动脉粥样斑块形成，而VWF 缺陷的小鼠中动脉粥样斑块较少［4］；F2 激活是凝血过程的第一步，故抗凝治疗为冠心病重要治疗方案； 血管表皮生长因子（EGF） 介导的信号级联在血管新生过程中发挥重要作用，是最重要的促血管形成和分化调节因子之一，细胞在缺氧时其合成量会升高12 倍，可明显促进全身多处组织器官的血管内皮细胞增殖、迁移、趋化［5-6］；肌细胞特异性增强因子2A（MEF2A） 在动脉粥样硬化小鼠主动脉内皮细胞中表达降低，该基因沉默可明显上调小鼠主动脉内皮细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1、纤溶酶原激活物抑制剂-1 表达［7］。

图5 KEGG 通路富集分析高级气泡图Fig.5 Senior bubble chart for KEGG pathway enrichment analysis

血管扩张方面，一氧化氮合酶（NOS） 催化左旋精氨酸时可产生NO，具有强烈的扩血管作用，能降低平均动脉血压，调节全身各血管静息张力，也是心脏血流动力学调节的重要因子［8］。炎症反应方面，跨膜受体蛋白1（Notch1） 在巨噬细胞分化过程中可促进M1 型巨噬细胞的激活和细胞因子的释放引起炎症反应，导致动脉粥样硬化，干扰Notch1 信号通路则可明显促进抗炎症型M2 型巨噬细胞的产生，上调抗炎症细胞因子的分泌［9］；半乳凝集素（LGALS） 可结合CD98 促进巨噬细胞激活，活化的巨噬细胞分泌纤维化细胞因子，刺激肌成纤维细胞的转化，最终参与不良心脏重构和心肌纤维化。MacKinnon 等［10］发现，动脉粥样硬化小鼠中缺乏LGALS 的内皮下几乎没有动脉斑块形成。抗氧化方面，机体在缺血、缺氧时可产生大量氧自由基，肌红蛋白（MB） 是一种含亚铁血红素的低分子，可运输和储存氧气，不同原因引起心肌组织损伤均可导致血液中MB 水平增加，故它是急性心梗早期最灵敏的指标；超氧化物歧化酶（SOD） 是生物体内最重要的抗氧化酶，为生物体内清除氧自由基的首要物质，其血清水平与血管结构和功能密切相关，故可用于标记心血管变化；调脂方面，上调胆固醇-7α 羟化酶（CYP7A1） 和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα） 表达可调节血脂［11］，降低血压，以达到改善动脉粥样硬化的目的；醛固酮是肾素-血管紧张素系统的一部分，其激活程度与冠心病严重程度密切相关，川芎有效成分可能通过与醛固酮受体结合，以负反馈机制减少醛固酮的分泌，减低激活程度，降低血压。然后，对31 个主要靶点进行GO 富集分析，得到其涉及的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC） 相关信息。

P＜0.05 的前20 个生物过程中与冠心病相关的有17 个，主要涉及氧化应激反应、凝血、血管生成、血管扩张、血压调节等方面。缺氧时，机体产生大量的氧自由基，超氧化物歧化酶将这些氧自由基转变为过氧化氢，然后由过氧化氢酶转变为无害的水和氧，以减轻缺氧对机体造成的损害，而且此时可激活缺氧诱导因子，缺氧诱导因子可使血管再生和修复微血管梗阻［12］；根据凝血酶原激活物形成始动途径和参与因子的不同，可将凝血途径分为内源性、外源性，前者蛋白参与心血管疾病发生，导致血栓形成［13-17］；血小板通过脱颗粒作用释放EGF，促进血管内皮细胞增殖，刘一剑等［18］研究表明，其水平升高在冠心病的发生发展中可能作为一个独立危险因子存在；MEF2A 基因沉默可明显上调ICAM-1、VCAM-1、PAI-1 表达，其变异更容易导致冠心病的发生［19］；nNOS 不仅可生成NO 来扩张血管，还可生成H2O2，同样可起到扩张血管的作用，大鼠血管内膜被乙酰胆碱刺激后会增加nNOS 生产H2O2［20］；刘红琼等［21］报道， 脉压、脉压指数与高血压患者冠心病发生有关，特别是脉压指数越大，冠心病发生率越高，冠脉病变越严重，故血压调节对冠心病治疗非常重要。

P＜0.05 的分子功能有9 个，涉及抗氧化、延长作用时间、保护心肌、抗凝4 个方面。血红素结合蛋白是一种血浆急性期糖蛋白，其功能主要是与循环中多余的游离血红素结合，并转移到特定的细胞处理［22］，对抗氧化应激反应，减轻多余的游离血红素造成的组织损伤［23］；蛋白结合是指药物进入血液循环与血浆蛋白的结合，成为结合型药物，暂时失去一般药理活性，并“储存” 在血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短有重要意义，一般蛋白结合率高的药物体内消除会比较慢，作用维持时间长，川芎化合物与血浆蛋白的结合力较强［24］；石天尧等［25］发现，心肌缺血／再灌注大鼠模型血清中肌酸激酶活性和丙二醛水平显著降低，表明半乳糖苷具有明显的心肌保护作用；一些研究表明，经高镁培养基培养的内皮细胞中NO 产生增加，可防止NF-κB 活化，降低基质金属蛋白酶9（MMP-9） 活性，上调VWF 蛋白水解，抑制血小板黏附［26-27］，达到抗凝效果。

P＜0.05 的细胞成分有9 种，涉及炎症反应、内质网应激反应、氧化应激反应3 个方面。血小板α 颗粒是血小板中可分泌蛋白质的主要贮存部位，在冠状动脉粥样病变时其膜蛋白表达增高，从而介导炎症细胞黏附聚集在动脉粥样斑块周围，造成局部炎症细胞的浸润性反应，释放大量组织活性因子，在这些组织活性因子的共同作用下最终导致斑块稳定性下降、斑块破裂［28］；内质网（ER） 是在真核细胞中发现的一种细胞器，约有30 多种膜结合蛋白，另有30 多种位于内质网腔，其分布具有异质性，在冠心病患者中同型半胱氨酸诱导内皮祖细胞内质网应激介导的半胱天冬酶3 活化增强，证明内质网应激反应与冠心病的发生机制可能存在关联［29］；过氧化物酶体是一种存在于几乎所有真核细胞中的细胞器［30］，可把氧自由基转化为H2O2而发挥抗氧化的作用。

对川芎作用于冠心病主要的31 个靶点进行KEGG 通路富集分析，得到P＜0.05 的通路6 条。其中，补体级联与凝血级联、缺氧诱导因子-1 信号通路、过氧化物酶体通路与冠心病相关，涉及凝血过程、炎症反应、氧化应激反应、血管扩张、心肌保护等方面；凝血因子是凝血过程的主要参与者，川芎作用于冠心病的主要靶点包括多种凝血因子，由此推测它可能通过抑制其表达来达到抗凝的目的，从而改善冠状动脉粥样硬化的程度；补体系统成分由30 多种蛋白质和蛋白质片段组成，主要分为固有成分 （C1qrs-C9、 B／D／P 因子、 MBL、丝氨酸蛋白酶等）、补体受体（CR1、CR2、CR3、C3a R，C5aR 等） 和调节分子（C1INH、DAF、H因子等），黄政［31］认为，后处理能够上调HSP90表达，并减少缺血-再灌注（缺氧／复氧） 诱导的补体C3／C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α 表达及心肌细胞凋亡；早期缺氧时，缺氧诱导因子激活后可激活下游EGF、NOS2 基因表达，EGF 表达可促进新生毛细血管生成，NOS2 作为催化剂参与产生NO，进而扩张血管，调节心脏血流；研究表明［32］，缺氧时HIF-1α 表达增加能活化VEGF 基因转录，增强其mRNA 稳定性，上调其mRNA 表达，从而促使血管生成，降低缺氧对组织的负面影响；缺氧诱导因子-1α（HIF-1α） 是机体细胞在低氧环境中产生的一种转录因子，参与低氧反应基因的调控，可促进血红素氧化酶-1 （HO-1）、 血管生长因子（VEGF） 等因子表达，其中HO-1 具有抗氧化、抗炎、扩张血管作用，被认为是血管保护因子，而且HIF 诱导的HO-1 对缺血-再灌注损伤具有长期的心肌保护作用［33］。

综上所述，川芎可能主要通过抗氧化、抗炎、抗凝血、促进血管生成、扩张血管、调节血压等方面来治疗冠心病。但本研究仅对一些数据库进行挖掘，对川芎的功效作用进行预测，今后在基础研究、临床实验中还需要进一步验证。化合物以OB和DL 作为筛选条件也存在一定局限性，如川芎嗪注射液目前在临床上已取得广泛应用，故不能仅依靠口服利用度来筛选化合物，该值较低者也需要加以重视。另外，本研究只对川芎进行了研究，而在临床上它大多与其他中药进行配伍来治疗冠心病，同时各中药之间的相互作用也未能得到体现，需要不断完善。