养殖大菱鲆病原菌耐药现状与用药建议

文/王鹤 王力勇 刘朋 潘秀莲 王亮 贺加贝

本文通过稀释法研究大菱鲆对14种抗生素类药物的耐药情况，进而针对采样点提出了切实有效的用药建议。药物应当交替使用，避免长期过量使用造成耐药，引发经济损失。本次数据仅限于此采样点，不能区域通用。

抗生素作为防治水生动物细菌病的首选药物，在大菱鲆弧菌病和爱德华氏菌病的防治中亦有广泛应用。长期、大量使用抗生素极易产生耐药性，导致药物治疗失败，进而造成经济损失。准确把握病原菌的耐药性对于细菌病的有效防治至关重要，在掌握耐药现状的基础上根据其对抗菌药物的敏感程度和耐药程度，提出用药建议可减少因盲目用药引起的抗生素乱用。在全球减抗限抗大背景下，如何提高用药针对性和精准度、减少抗生素类药物滥用乱用，切实推进基层水产养殖用药减量增效、促进渔业绿色健康发展需要渔业相关部门提供解决方案。

根据农业农村部“动物疫情监控与防治（渔业）——病原菌耐药性普查”工作安排，试点单位采集山东省烟台市大菱鲆养殖主产区某生产企业样品，分离病原菌、测定菌株耐药性，在此基础上提出了精准施药建议，为促进大菱鲆养殖业绿色健康持续发展提供了数据支撑。

一、材料与方法

（一）供试菌株的分离鉴定

供试菌株为采集病鱼自行分离纯化的病原菌。2018年7月～10月每月采集样品3尾，累计采样4次，共计12尾。每次采集定点养殖场中发病濒死或有典型病症的大菱鲆活体充氧带回实验室，当天完成病原菌分离。用75%酒精棉球擦拭鱼体后，用灭菌剪刀于肛门前端入剪，分离内脏器官，选取心、肝、肾、脾等组织或器官用灭菌双蒸水清洗表面后，划线接种于选择性培养基中。根据病鱼外观症状疑似弧菌病的接种于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（TCBS）中分离培养，疑似爱德华氏菌病的接种于麦康凯培养基中分离培养，培养条件为（28±1）℃，24h～48h后观察菌落特征，挑取单菌落接种于脑心浸液培养基（BHIA）分离纯化，经至少2次纯化后得到病原菌株纯培养物。纯培养物于BHIA斜面保存2份，一份寄上海海洋大学用于菌株鉴定，一份自留用于药物敏感性测试。细菌的鉴定为分子生物学方法，用16S rDNA保守序列通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）以病原菌株纯化物为底物进行菌液PCR，经测序后进行NCBI数据库比对，确定分离菌株的种属。

（二）供试药物

供试的抗生素类药物全部由全国水产技术推广总站提供，为粉状原料药。药物分别为：盐酸多西环素、硫酸新霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、强力霉素、氨苄西林钠、恩诺沙星、氟苯尼考、硫氰酸红霉素、交沙霉素、甲砜霉素、盐酸土霉素，共计14种。

（三）供试菌株最小抑菌浓度的测定

试验方法为稀释法。将总站提供的原料药按照操作规程方法溶解后，分别用灭菌双蒸水定容至20mg/mL，作为母液备用。在直径为12mm的玻璃管中加入MH肉汤培养基，应用等倍稀释法依次设置10个药物梯度，管内药物终浓度依次为100.00μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.20μg/mL。用生理盐水配置纯培养物菌悬液，经分光光度计确定浓度后，分别加于各药物浓度梯度中，使菌液在各药物梯度中的终浓度为105个/mL～106个/mL。（28±1）℃培养，24h～48h观察记录菌株生长情况，以菌液是否浑浊作为判定标准，以抑制菌株生长的最高稀释度作为该菌株测试药物的最小抑菌浓度（MIC）。

（四）数据统计方法

根据美国临床实验室标准研究所（CLSI）发布的药物敏感性及耐药性标准对菌株耐药性进行判别。判别标准如下诺氟沙星类、盐酸多西环素、盐酸土霉素敏感（S）：MIC≤4μg/mL，中敏（I）：MIC=8μg/mL，耐药（R）：MIC≥16μg/mL；氟苯尼考、甲砜霉素、硫酸新霉素敏感（S）：MIC≤2μg/mL，中敏（I）：MIC=4μg/mL，耐药（R）：MIC≥8μg/mL；红霉素敏感（S）：MIC≤0.5μg/mL，中敏（I）：MIC在1μg/mL～4μg/mL之间，耐药（R）：MIC≥8μg/mL；氨苄西林敏感（S）：MIC≤8μg/mL，中敏（I）：MIC=16μg/mL，耐药（R）：MIC≥32μg/mL；磺胺类敏感（S）：MIC≤38μg/mL，耐药（R）：MIC≥76μg/mL。应用Excel软件统计各供试菌株试验结果。

图1 病原菌分离鉴定结果

菌株敏感率（%）=（敏感菌株数量÷菌株总数）×100%

MIC50为抑制50%受试菌株生长所需的最小抑菌浓度；

MIC90为抑制90%受试菌株生长所需的最小抑菌浓度。

二、结果与分析

（一）养殖场病害、药物使用及损失情况

7月～10月间，采样单位未发生面积超过养殖面积2%以上的大范围病害，腹水病和肠炎病偶有发生，发病率在1%～2%之间。养殖单位发现患病个体立即捞出隔离、无害化处理，定期施用氟苯尼考作为预防性用药。全年未发生因病致损的情况。

（二）病原菌分离鉴定结果

4次采样累计采集大菱鲆病鱼12尾用于病原菌分离，共分离纯化获得病原菌37株，经上海海洋大学测序鉴定，最终反馈回28株测序结果。在测回的28株菌中，弧菌9株（32.14%），包括大菱鲆弧菌8株（28.57%）、大西洋弧菌1株（3.57%）；爱德华氏菌19株（67.86%），均为迟缓爱德华氏菌，见图1。

（三）菌株对抗菌药物的感受性

分别用14种供试药物对分离纯化并反馈测序结果的28株菌进行耐药性测试，各菌株对不同抗生素的感受性结果详见表1、2。其中弧菌对盐酸多西环素及硫酸新霉素的MIC集中在≤0.20μg/mL；对硫酸新霉素的MIC≤12.5μg/mL，集中在0.20μg/mL左右；对恩诺沙星的MIC介于0.20μg/mL～0.78μg/mL之间；对磺胺类药物除一株MIC=25μg/mL外，均大于100μg/mL；强力霉素MIC范围6.25μg/mL～12.5μg/mL；氨苄西林钠、甲砜霉素MIC≥100μg/mL；氟苯尼考、硫氰酸红霉素、交沙霉素、盐酸土霉素MIC集中在50μg/mL～100μg/mL。

表1 弧菌对供试药物耐受性结果汇总

表2 迟缓爱德华氏菌对供试药物耐受性结果汇总

表3 病原菌对抗菌药物的敏感性

爱德华氏菌对盐酸多西环素MIC介于0.78μg/mL～1.56μg/mL，硫酸新霉素、磺胺类、甲砜霉素MIC≥100μg/mL，强力霉素、氨苄西林钠MIC集中于6.25μg/mL～12.5μg/mL，恩诺沙星MIC范围0.78μg/mL～6.25μg/mL，氟苯尼考MIC范围3.12μg/mL～6.25μg/mL，盐酸土霉素MIC范围集中于25μg/mL～50μg/mL。

（四）菌株耐药率

根据各菌株对药物的耐受性结果，以CLSI相关标准为判定依据，对分离菌株的耐药性进行统计，详见表3及图2。经统计，本次分离的菌株具有较高的耐药率，在所有测试药物中仅20.54%的菌株对抗生素类药物表现为敏感，10.12%的菌株表现中敏，69.34%的菌株耐药，且菌株有多重耐药现象，大部分菌株对8种～10种抗生素同时表现为出耐药性。其中，弧菌相较于爱德华氏菌耐药情况更为严重。弧菌耐药菌株占全部菌株比例为75.00%，敏菌株占比0.93%；迟缓爱德华氏菌耐药菌株占66.67%，敏感株占比14.47%。测试结果显示分离纯化的菌株对磺胺类药物普遍耐药，所有菌株在盐酸土霉素、甲砜霉素、红敏素、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶六种药物中均表现为耐药。

弧菌耐药率低于5%的药物有恩诺沙星和盐酸多西环素，MIC90＜0.78μg/mL，此外，硫酸新霉素的耐药率也相对较低，为11%，MIC90=12.5μg/mL；爱德华氏菌耐药率低于5%的药物有恩诺沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考和氨苄西林钠，药物MIC90均小于12.5μg/mL；尽管爱德华氏菌对氟苯尼考的耐药率不高，但菌株100%表现为中敏，氨苄西林钠中敏率也较高（63.16%），这两种药在生产中使用不当易产生耐药。大西洋弧菌与大菱鲆弧菌在各类药物的耐药性方面并未表现出明显差异，与大菱鲆弧菌耐药性基本一致。弧菌和爱德华氏菌的菌株耐药率见图3、图4。

图2 病原菌对抗生素类药物耐药率比较

图3 弧菌菌株耐药谱型

图4 爱德华氏菌菌株耐药谱型

三、用药建议

综合试验结果，该单位分离的病原菌对恩诺沙星、盐酸多西环素最为敏感，在生产中使用此类药物会有较好的治疗效果，因此推荐恩诺沙星、盐酸多西环素作为该单位防治大菱鲆细菌病的首选药物。除此之外，硫酸新霉素对弧菌引起的肠炎病可能会有较好的治疗效果，氟苯尼考、氨苄西林钠对迟缓爱德华氏菌引起的腹水病可能有一定的效果。磺胺类、盐酸土霉素、甲砜霉素、红敏素等药物不推荐在生产中使用。

该场以氟苯尼考作为大菱鲆细菌性疾病防治的首选药物，定期施用。但根据实验结果，病原菌尤其弧菌，对氟苯尼考已经产生了一定的耐受性，故氟苯尼考不宜作为肠炎病的防治药物继续施用。对于迟缓爱德华氏菌引起的腹水病来说，氟苯尼考有一定的治疗效果，但应注意与其他药物交替使用，避免长期过量使用造成耐药，进而导致治疗失败引发经济损失。

对比辽宁省大菱鲆耐药普查试验结果，辽宁省分离的病原菌对氨苄西林、甲砜霉素、磺胺类药物的敏感性测试结果、耐药状况与本实验结果基本一致；推荐诺氟沙星、盐酸多西环素等作为弧菌病防治首选药物的防治建议，亦与本试验结论相似。

但在分离的菌株种类、各菌株对某些药物耐药性方面，有不同结论。与辽宁每月能分离20株～63株弧菌的结果相比，本采样点分离的弧菌数量明显少，且无季节变化。不同于辽宁采样点10℃～17℃的水温变化，本采样点大菱鲆养殖用水为深井海水，常年水温恒定于（17±2）℃，盐度（28±1），推测该地水质状况较好且指标稳定，故分离的弧菌数量较少无明显季节变化。由于弧菌为条件性致病菌而爱德华氏菌是真正的病原菌，结合该单位分离到的迟缓爱德华氏菌较多的情况，提示养殖单位应着重防控，避免爆发大范围病害。此外，分离到的病原菌对某些药物的耐受性亦有不同表现。本区域分离的菌株对氟苯尼考已产生一定耐受性，中敏率较高，而辽宁分离的弧菌对氟苯尼考的耐药率仅为15.38%。

山东地区与辽宁地区养殖大菱鲆细菌性病原菌的耐药现状存在共性的同时亦有差别，该情况与区域性水质状况、用药习惯、采样单位生产管理水平等多方面因素有关。

上述数据仅限于山东地区的一个采样点，尽管分离到的菌株整体耐药率较高，但并不能代表山东地区的整体情况，用药建议亦不能区域通用。若要提出更科学的区域性用药建议，应在广泛采集养殖区域样本，全面了解病原菌耐药现状的基础上提出。