浦口区草鱼、鲫鱼致病菌的分离鉴定和耐药性分析

张仁展，蔡德森，江青松

（南京市浦口区水产技术指导站，江苏 南京 211800）

浦口区共有水产养殖面积2 400 hm2，其中常规鱼养殖分布在永宁、汤泉和星甸街道，以草鱼、鲫鱼为主，面积约680 hm2。每年细菌性病害对浦口区草鱼和鲫鱼的养殖都会造成一定损失，为了解致病菌的耐药情况，从不同养殖地点采集草鱼和鲫鱼，分离体内致病菌，同时进行体外药敏试验，为全区水生动物细菌性疾病的科学用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2017年6月—2018年10月，在各养殖集中区池塘共采集草鱼发病样品9个、鲫鱼发病样品26个。分别取肝、肾或脾进行细菌培养分离。

1.2 主要试剂

非苛养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（API 20NE）购自上海嘉合生物科技有限公司。药敏板购自南京菲恩医疗科技有限公司，营养琼脂、RS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基购自北京陆桥生物技术有限责任公司。

1.3 菌株分离与纯化

使用灭菌棉签蘸取发病样品肝脏、肾脏或脾脏，均匀涂布于营养琼脂培养基，28℃培养18～24 h，分离出单个菌落，并用接种环挑取单菌落，继续划线接种于营养琼脂培养基，28℃培养18～24 h，进一步纯化。

1.4 菌株致病性判断

经2次分离纯化后的菌落，接种于脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基，28℃培养18～24 h，若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，则判定为具有致病性。

1.5 菌株鉴定

用接种环挑取纯化后的单菌落于生理盐水中，制成0.5 MCF的菌悬液，按操作要求将菌悬液分别接种到细菌鉴定试剂条（API 20NE）小管中，于30℃培养18～24 h。取试剂条与结果读取表比对得出反应结果数据，通过API 20NE菌谱检索手册得到鉴定结果。从35个样品中，共分离出菌株52株（2017年和2018年各分离出26株），其中嗜水气单胞菌35株，温和气单胞菌8株，创伤弧菌4株，荧光假单胞菌1株，洋葱伯克霍尔德菌4株。

1.6 最小抑菌浓度的测定

利用定制药敏板（96孔板）测定恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、红霉素、乳酸环丙沙星、盐酸土霉素、强力霉素共8种常见药物的敏感程度（其中红霉素和乳酸环丙沙星为水产养殖禁用渔药，该文不作分析）。首先用接种环挑取纯化后的单菌落于生理盐水中，制成0.5 MCF的菌悬液，从中吸取0.2 mL加入到20 mL无菌生理盐水中，混匀，倒入经灭菌的V形槽内，然后用排枪移液器吸取该混合液，加入药敏板所有的小孔中（第二列阴性对照除外），每孔0.2 mL，并在阴性对照孔中加入等量生理盐水。盖好试剂板，置于35℃培养箱培养18～24 h（必要时延长培养时间）。经肉眼观察证实无细菌生长小孔中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 结果与讨论

2.1 嗜水气单胞菌对抗菌药物的感受性

嗜水气单胞菌广泛分布于自然环境中和水生动物体内，是一种典型的条件致病菌，可大规模引起淡水鱼类皮肤溃疡和急性出血性败血症[1]，是一类危害极其严重的水产动物病原菌。35株嗜水气单胞菌对各种抗菌药物感受性测定结果如表1所示。

2.2 温和气单胞菌对抗菌药物的感受性

温和气单胞菌可引起多种鱼类患细菌性败血症和肠道疾病[2]。8株温和气单胞菌对各种抗菌药物感受性测定结果如表2所示。

2.3 创伤弧菌对抗菌药物的感受性

创伤弧菌可引发水生动物败血症和多种炎症[3]。4株创伤弧菌对各种抗菌药物感受性测定结果如表3所示。

表1 嗜水气单胞菌对各种抗菌药物的感受性

表2 温和气单胞菌对各种抗菌药物的感受性

表3 创伤弧菌对各种抗菌药物的感受性

2.4 荧光假单胞菌对抗菌药物的感受性

荧光假单胞菌是引起水生动物赤皮等疾病的致病细菌。1株荧光气单胞菌对各种抗菌药物感受性测定结果如表4所示。

2.5 洋葱伯克霍尔德菌对抗菌药物的感受性

在实验过程中还筛选到4株洋葱伯克霍尔德菌，其对各种抗菌药物感受性测定结果如表5所示。

表4 荧光假单胞菌对各种抗菌药物的感受性

表5 洋葱伯克霍尔德菌对各种抗菌药物的感受性

不同抗生素的药敏试验敏感性结果判定标准有所不同，参照动物源细菌药敏试验标准（CLSI M100-S23），对药物的敏感性及耐药性判定范围划分如表6所示。依据这一划分范围，将所有抗菌药物对各表中菌株的MIC值测定结果进行判定，得出了所有菌株对各抗生素的感受性结果[4]，如表7所示。

表6 药物的敏感性及耐药性判定范围划分 μg/mL

从试验结果分析，采样分离到的病原菌对不同抗生素类药物表现了不同程度上的敏感性和耐药性。其中，分离菌株对恩诺沙星、硫酸新霉素这2种药物敏感率很高，均在90%以上，对强力霉素敏感率相对较高为75%，说明这3种药物对一些水生动物病原菌有较好的抗菌效果，而分离菌株对甲砜霉素耐药率最高，达到71.15%，这说明甲砜霉素的抗菌效果相对较差。

表7 所有菌株对供试药物感受性测定结果 %

如表8所示，比较2017年和2018年分离菌株的MIC加权平均值（MIC加权平均值=Σ（菌株数×对应的MIC值）/菌株总数）[5]，可看出，恩诺沙星和硫酸新霉素的MIC加权平均值分别下降了75.21%和69.05%，表明2年内病原菌对这两种药物的耐药性降低；而甲砜霉素和氟苯尼考的MIC加权平均值分别提高了143.64%和693.59%，这表明病原菌对这两种药物的耐药性显著增强，尤其是氟苯尼考，这可能与现阶段水产养殖过程中频繁使用该药有关。

表8 分离菌株的MIC加权平均值 μg/mL

从试验结果来看，水产病原菌已对多种抗生素产生了不同程度的耐药性。因此，水产从业者在治疗细菌性疾病时，应当科学选择用药的种类和剂量，避免将同类抗菌药物在同一个养殖环境下多次使用；同时也要着重加强水生动物免疫系统建设，进一步增强水生动物自身抗病能力；此外，还应严格遵守休药期制度，多方面综合把关才能减缓致病菌耐药性的产生。