儿童初诊原发免疫性血小板减少症患者细胞及体液免疫功能分析

倪蔚文，储金华，杨林海，刘亢亢，王宁玲

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是一种儿童常见的获得性自身免疫性出血性疾病，年发病率约为(1～6.4)/100 000，发病高峰年龄为2～5岁[1]。该病存在重要脏器或颅内出血引起死亡的风险，据报道，重症ITP患者的死亡率每年约为1%～3%[2-3]。初诊ITP患儿的预后一般较好，其对糖皮质激素、静脉丙种球蛋白(intravenous immune globulin, IVIG)一般都有较好的治疗反应。然而，仍有约20.0%的患儿治疗效果不佳，病程迁延、进展为慢性ITP[4]。

免疫紊乱在ITP的发病机制中具有重要作用，但其发病机制目前尚不明确，目前的研究认为体液免疫和细胞免疫异常都可能参与了ITP的发病。然而，由于ITP好发于年轻女性及年龄大于60岁的老年人，目前的许多研究都是针对成人患者，针对儿童患者的研究则较少。该研究旨在对收治的51例初诊ITP患儿的临床资料及相关免疫指标进行分析，提高临床上对儿童ITP发病机制的认识，从而为临床上合理选择药物提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集安徽医科大学第二附属医院2013年1月～2018年6月确诊的51例初诊ITP患儿的临床资料。诊断标准依靠2013年版《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》[5]。在收集这些患儿临床资料的同时，进一步分析了与患儿细胞免疫及体液免疫相关的实验室指标，包括球蛋白、免疫球蛋白(包括IgG、IgA、IgM)、补体(C3及C4)、淋巴细胞亚群[包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)]。同时选取了30例体检结果正常者作为健康对照组(组1)用于比较体液免疫功能相关的数据，另20例体检结果正常者用于比较淋巴细胞亚群的健康对照组(组2)。所有患儿的血液标本均在开始治疗前采集。所采集的血液标本均保存在肝素钠(1 ∶9)抗凝管中，并在采集后4 h内处理。

1.2 流式细胞术检测外周血免疫细胞亚群

1.2.1试剂和仪器 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD4(克隆号：13B8.2)、CD20(克隆号：L26)，藻红蛋白(PE)标记的CD8(克隆号：B9.11)、CD19(克隆号：J3.119)、CD16+56(克隆号：3G8)、CD25单抗(克隆号：B1.49.9)、CDl27单抗(克隆号：R34.34)，叶绿素蛋白偶联物(PC5)标记的CD3(克隆号：UCHT1)、CD45(克隆号：J.33)、CD4单抗(克隆号：13B8.2)及各自对应的同型阴性对照试剂购自美国Beckman-Coulter公司；溶血剂为去离子蒸馏水配制的0.83%氯化铵溶液，由本实验室自行配置；流式细胞仪型号为FC500-MCL，购自美国Beckman-Coulter公司。实验数据应用CXP系统进行分析。

1.2.2步骤 ① 采集静脉血2～3 ml，应用肝素抗凝管，室温下放置，4 h内检测。② 将抗凝血100 μl分别加入4只12 mm×75 mm试管，然后1管加入CD4-FITC、CD8-PE及CD3-PC5单抗各10 μl，第1只加入CD19-PE、CD20-FITC及CD45-PC5各10 μl，第2只加入CD3-PC5及CD16+56-PE各10 μl，第3只加入CD4-PC5、CD25-FITC及CD127-PE各10 μl，第4只加入同型对照10 μl。③ 混匀，室温下避光反应15 min，然后加入1 ml溶血剂并置于37 ℃水浴箱10 min，完全溶血后上机检测。检测前调节流式细胞仪光流路质量调控和荧光补偿。检测时首先对淋巴细胞群进行设门，依据前向(FSC)和侧向(SSC)散射光信号。每份标本获取设门内细胞不少于10 000，并保存数据进行分析。

2 结果

2.1 入组患者一般临床资料共51例初诊ITP患儿入组，其中45例(88.2%)患儿有皮肤瘀点瘀斑、牙龈或消化道出血等出血性症状。初诊组血小板计数较健康对照组明显降低。所有患儿的年龄、性别与健康对照组比较差异均无显著性，见表1。

2.2 初诊ITP患者的免疫球蛋白及补体水平同时比较了初诊ITP与健康对照组(组1)与体液免疫功能相关的实验室指标，结果发现，ITP组血清IgG水平较健康对照组明显升高[(16.70±8.19)vs(9.65±3.08)]，差异具有统计学意义(P<0.001)。而IgA、IgM及补体C3、C4差异无显著性，见表2。

2.3 初诊ITP患者的细胞免疫功能为了分析初诊ITP患者细胞免疫功能，进一步分析外周血淋巴细胞亚群，结果发现：① ITP组CD4+T细胞及CD8+T细胞与健康对照组均有明显差异[CD4+T细胞：(30.91±8.23)vs(38.25±6.39)，P=0.003；CD8+T细胞：(34.53±4.73)vs(31.44±4.46)，P=0.037]，CD4/CD8比值明显低于健康对照组[(0.92±0.29)vs(1.24±0.27)]，差异有统计学意义(P=0.001)；② ITP组B细胞水平明显高于健康对照组[(8.85±5.53)vs(4.28±1.91)，P=0.001)]，NK细胞水平明显低于健康对照组[(9.30±4.97)vs(13.37±5.72)，P=0.020)]；③ ITP组CD4+Treg细胞水平明显低于健康对照组[(4.14±1.69)vs(5.47±0.94)，P=0.004]，见表3。

表1 初诊ITP组与健康对照组一般临床资料比较

t1、P1：初诊ITP组与健康对照组1比较；t2、P2：初诊ITP组与健康对照组2比较

表2 初诊ITP与健康对照组体液 免疫功能相关指标水平

表3 初诊ITP与健康对照组细胞免疫功能相关指标水平

※为占淋巴细胞门；△为占 CD3+T细胞门；○为占CD4+T 细胞门

3 讨论

目前ITP的治疗已有标准的诊疗指南作为指导，但仍有相当一部分患者对一线治疗药物无效或治疗有效后复发。ITP的发病机制十分复杂，目前并没有统一的认识。许多研究发现免疫异常与ITP的发病密切相关，因此进一步分析ITP患儿初诊时的细胞及体液免疫对于研究ITP的发病机制都具有重要意义。本研究分析了51例初诊的ITP患儿的体液免疫及细胞免疫相关指标水平，证实了这些患儿体内确实同时存在着细胞及体液免疫异常。目前已有许多研究对ITP患者T细胞亚群水平进行了报道，El-Rashedi et al[6]发现CD4/CD8比值降低和CD8+T细胞比例升高，Koyanagi et al[7]发现CD4/CD8比值与健康人无统计学差异。本研究表明CD4/CD8比值在初诊ITP患儿外周血较正常人明显降低，提示CD8+T细胞在ITP的发病机制中可能发挥重要作用。有研究[8]也证实，在抗血小板抗体阴性的患者体内可检测到CD8+T细胞介导血小板裂解的作用明显高于健康对照组，在已缓解的ITP患者体内CD8+T细胞介导血小板裂解的作用与健康对照组却无明显差异。总之，ITP患者体内确实存在着免疫紊乱，但CD4+及CD8+T细胞为两大类细胞群，均包含许多不同表型及功能的细胞亚群，仅依靠CD4/CD8比值不足以反映ITP患者的免疫状态。这也可能是不同研究所报道的结果不一致的原因。

NK细胞是人体固有免疫细胞，它同样参与了ITP的发病，主要通过调节B细胞分泌抗体。目前关于NK细胞在ITP中研究的文献较少且结论并不统一，有研究[9]显示ITP患者外周血循环NK细胞的比例正常但功能下调，本研究表明，初诊ITP患儿的NK细胞比例较健康对照组明显降低。本研究结果与Talaat et al[10]、El-Rashedi et al[6]的结果相符。

B细胞同样与ITP的发病密切相关。早期有学者将ITP患者的血清输注到健康志愿者体内，后来这些患者发生血小板计数明显下降，随后的研究发现抗血小板抗体IgG在其中发挥主要作用。抗血小板抗体通过结合血小板表面糖蛋白或小板表面糖蛋白复合物，或通过调节补体的细胞毒作用等方式溶解血小板[11]。本研究也表明，ITP患儿B细胞水平及IgG水平明显升高，提示体液免疫异常同样与ITP的发病密切相关。正因为B细胞参与了ITP的发病，目前临床上已应用利妥昔单抗靶向清除B细胞来治疗ITP，且取得了一定的疗效。

Treg是一类具有免疫无能和免疫抑制功能的细胞群，在自身免疫性疾病中发挥重要作用[12]。Yu et al[13]发现ITP患者的Treg水平与健康对照组无统计学差异，但许多研究[14-15]都证实ITP患者存在Treg细胞水平或功能的下调，这与本研究结果一致。Treg细胞发挥免疫抑制作用的机制尚不明确，目前认为主要包括以下几个方面。① Treg细胞可通过分泌免疫抑制因子发挥免疫抑制作用，如TGF-β、IL-10和IL-35；② Treg细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶对活化的效应器T细胞产生直接的细胞毒性；③ Treg细胞通过细胞表面免疫抑制分子使效应T细胞失活，如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和Fas配体；④ Treg细胞与CD4+T细胞竞争与抗原呈递细胞的相互作用。