蛋白激酶D1调控胶原表达逆转心肌梗死后心室重构的作用

杨 雷，刘 暖，毛秉豫

心肌梗死(myocardial infarction, MI)后心肌组织的缺血受损可导致心室重构(ventricular remodeling, VR)；心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在VR的进程中发挥着重要的作用，特别是和ECM的主要组成成分Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ， ColⅠ)和Col Ⅲ的大量积聚密切相关[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的主要功能之一是降解ECM，而ECM的过度降解也是引发VR的重要原因之一[2]。在组织重塑过程中，基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitors， TIMPs)被分泌并抑制MMPs的活性水平。因此MMPs和TIMPs的动态平衡调节也是影响VR的关键因素之一[2]。前胶原C端蛋白酶增强子(procollagen C-terminal protease enhancer， PCPE)、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine， SPARC)、粘胶蛋白/肌腱蛋白C(tenascin C， TN-C)和核转录因子(nuclear transcription factor， NF-κB) p50也是参与胶原代谢的代表性调控蛋白[2-3]。

研究[4-6]表明，蛋白激酶D1(protein kinase D1, PKD1)具有促缺血受损心肌组织血管新生的作用，但其对MI后心肌胶原蛋白表达的调控作用尚不清楚。该研究旨在探讨PKD1给药4周是否会影响大鼠MI后的VR，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物45只SPF级雄性Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，8周龄，体质量200～220 g，所有动物在标准饲养的环境下(温度和湿度范围分别为22～26 ℃和53%～60%饲喂食物和饮水，并在南阳理工实验动物伦理委员会(实验批准号：NYIST-20180126)监控下进行。

1.2 药物与试剂PKD1购自美国Pierce公司；MMP-1、MMP-8、TIMP1、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C、NF-κB p50的一抗抗体均购自圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司；羊抗兔IgG二抗、DAB显色液、BCA蛋白测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 主要仪器164-5052型PowerPac HC电泳仪(美国BIO-RAD公司)；T25组织匀浆机(德国IKA公司)；HX-100E型小动物呼吸机、BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；ERM-3100型半自动病理切片机(苏州郝思琳科技有限公司)；TKY-BMB型石蜡包埋机(深圳博大精科技实业有限公司)；Nikon Tis型荧光显微镜及Nikon NIS-Elements Software BR分析系统(日本尼康公司)。

1.4 动物造模雄性Wistar大鼠45只，按照数字随机法分为3组，假手术组(Sham组)、模型组(Model组)和PKD1给药组(PKD1组)，每组大鼠均15只。参照之前的方法[6]，Model组和PKD1给药组结扎大鼠左冠状动脉前降支造成MI，Sham组仅履行手术程序但不结扎冠状动脉。术后3 d，PKD1组开始给予PKD1灌胃给药，即按照每日1 mg/(kg·d)的剂量稀释至2 ml生理盐水中，连续灌胃4周。Sham组和Model组每日生理盐水灌胃2 ml，连续4周。在4周结束时，应用戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，进行血流动力学评估。评估结束，75 mg/kg戊巴比妥钠深麻醉下颈总动脉放血法处死动物，进行后续分析。

1.5 血流动力学评估通过侵袭性手术评估动物的血流动力学数据。动物腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，将SPR-838压力容积导管经左颈动脉插入左心室(left ventricle, LV)腔内。连续监测LV的压力和容积，以便正确定位导管，定位后的导管被连接到压力换能器上。通过BL-420F生物机能实验系统记录左室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室压最大上升和下降速率等数据。

1.6 HE染色及心肌细胞横截面面积测定取处死后大鼠的心脏，将左心室与其他心脏结构分离，用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作组织学4 μm厚切片，参照之前的方法[4]，制作HE染色切片，根据Stefanon et al[7]所描述的方法，光学显微镜400×放大视野下对左心室未梗死区域心肌组织进行分析，每只大鼠观察5个视野，手动计数50个细胞(10个细胞/视野)，采用Nikon NIS-Elements Software BR分析软件测量心肌细胞横截面积，作为评估MI后心室肥厚程度的指标之一。

1.7 Masson染色心肌组织取材同HE染色部分。参照之前的方法[6]，制作Masson染色病理切片。染色后，心肌胶原纤维在光镜下呈蓝绿色，心肌组织呈现红色，胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)采用日本尼康公司的软件分析系统Nikon NIS-Elements Software BR进行分析。

1.8 Western blot检测取心尖部心肌组织，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液浸泡后，IKA-T25组织匀浆机将样品进行均匀化和离心分离，提取总蛋白。用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白量。取40 μg的蛋白质应用于SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白条带转移到0.2 μm硝酸纤维素膜上。用蛋白封闭液封闭2 h后与MMP-1、MMP-8、TIMP1、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的一抗抗体孵育。加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗，孵育2 h，置入DAB显色溶液中显色，以β-actin蛋白表达水平作为内参对照，AlphaView SA软件分析各样本与β-actin蛋白灰度的比值，记录蛋白相对含量。

2 结果

2.1 PKD1对MI大鼠血流动力学的影响与Sham组比较，Model组大鼠LVSP、左室压最大上升和下降速率值均减小(P<0.01)，而LVEDP增大(P<0.01)；与Model组比较，PKD1组大鼠LVSP、左室压最大上升和下降速率值均增大(P<0.01)，而LVEDP减小(P<0.01)，且所有值接近于Sham组大鼠。见表1。

2.2 PKD1对MI大鼠组织形态学的影响3组大鼠HE染色组织形态学结果表明，Sham组大鼠呈现清晰规整的红色心肌，细胞轮廓清晰；Model组大鼠心肌组织坏死严重，坏死的心肌被瘢痕组织取代，残存的心肌细胞明显肥大(绿色箭头)，成纤维细胞(黄色箭头)增生明显，伴炎症细胞(红色箭头)浸润；PKD1治疗组大鼠心肌细胞较Sham组仍显肥大，红色心肌组织结构清晰，少见坏死心肌和炎症细胞浸润，伴随明显的毛细血管和散在分布的红细胞。

表1 PKD1对MI大鼠血流动力学的影响

与Sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01

图1 PKD1对MI大鼠组织形态学的影响 HE×400

A： Sham组；B： Model组；C： PKD1组；绿色箭头示心肌细胞，黄色箭头示成纤维细胞，红色箭头示炎症细胞

表2 PKD1对MI大鼠心肌组织的胶原占比和心肌细胞截面积的影响

与Sham组比较:**P<0.01；与Model组比较:##P< 0.01

图2 PKD1对MI大鼠心肌纤维化的影响 Masson×400A： Sham组；B： Model组；C： PKD1组

见图1。

2.3 PKD1对MI大鼠心肌细胞截面积的影响3组大鼠非梗死区心肌细胞的截面积分析结果表明，Sham组大鼠心肌细胞的截面积正常；与Sham组比较，MI大鼠残存非梗死区域心肌组织中心肌细胞的截面积增大(P<0.01)；与Model组比较，PKD1组大鼠心肌组织中心肌细胞的截面积减小(P<0.01)，但较Sham组增大(P<0.01)。见表2、图1。这表明PKD1给药后可改善MI大鼠心肌细胞的肥大程度。

2.4 PKD1对MI大鼠心肌纤维化的影响3组大鼠心肌组织的纤维化程度和胶原占比分析结果表明，Sham组大鼠心肌组织中红色的心肌组织中间杂有蓝色的胶原纤维，但胶原占比较少；与Sham组比较，Model组大鼠残存的红色心肌组织较少，心肌组织坏死严重，坏死的心肌组织由大片蓝色的胶原纤维取代，胶原占比升高(P<0.01)；与Model组比较，应用PKD1后，心肌组织坏死的程度明显减轻，胶原纤维占比下降(P<0.01)。见表2、图2。这表明，PKD1给药后可改善MI大鼠心肌组织的坏死程度，降低心肌组织的胶原占比。

2.5 PKD1对MI大鼠心肌组织中胶原相关蛋白表达的影响Western blot结果表明，与Sham组比较，MI大鼠残存心肌组织中MMP-1、MMP-8、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的表达均升高(P<0.01)，TIMP1表达降低(P<0.01)；与Model组比较，PKD1组大鼠心肌组织中TIMP1的表达升高(P<0.01)，而MMP-1、MMP-8、ColⅠ、Col Ⅲ、PCPE、SPARC、TN-C和NF-κB p50的表达均降低(P<0.01)，但除了NF-κB p50的表达外，均仍高于Sham组(P<0.01)。这表明PKD1给药可影响MI大鼠心肌组织中胶原相关蛋白的表达。见图3。

3 讨论

MI后受损心肌组织的ECM中胶原产生和沉积增多，导致心肌纤维化、心室壁僵硬以及心肌的收缩和舒张功能障碍[8]。本研究表明，PKD1在改善MI大鼠心肌组织的血流动力学方面作用显著，这与之前的动物实验研究[4]结果相一致，表明PKD1治疗可减轻心脏的损伤程度，改善心脏的收缩和舒张功能障碍。

图3 PKD1对MI大鼠心肌组织胶原相关蛋白表达的影响

1：MMP-1；2：MMP-8；3：TIMP-1； 4：Col Ⅰ;5:Col Ⅲ;6:PCPE;7:SPARC;8:TN-C;9:NF-κB p50；与Sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01

本研究通过Masson染色分析评估了MI心肌组织的胶原占比，证实PKD1治疗可有效减轻心肌组织的纤维化程度。并证实PKD1可下调心肌组织中ColⅠ、Col Ⅲ、MMP-1和MMP-8的表达。MMPs在心肌组织中被激活后可迅速降解ECM成分，导致心室壁变薄和扩张，心肌纤维化而引发VR，甚至可能导致心功能衰竭[9]。因此，MI后MMPs的分泌增多很可能是VR及心力衰竭发生的起始因素[9-11]。TIMPs是MMPs的特异性内源性调节因子，TIMPs参与调控心肌炎症和心室腔扩张的进程[10]，是维持心室几何结构的基础[11]。本研究显示PKD1可下调MMP-1和MMP-8的表达，并上调TIMP1的表达。这表明PKD1可能通过上调TIMPs和下调MMPs的表达而减少ECM的过度降解，抑制心肌纤维化的进展，减轻心肌组织的胶原沉积，并最终逆转VR。

PKD1还通过调控两种特异性蛋白PCPE和SPARC的表达而影响胶原的合成。PCPE具有增强前胶原C蛋白酶调控合成新胶原蛋白的作用[12]。SPARC通过与胶原蛋白前体的结合而调节新胶原纤维的形成[13]。本研究证实，PKD1可下调PCPE、SPARC、ColⅠ和Col Ⅲ的表达水平。这表明PKD1可有效减少组织胶原的合成并促进其降解，从而改善心肌组织的纤维化程度。

TN-C参与新胶原分子的形成并调节NF-κB活化[14]。TN-C的缺失可减少MI后心肌纤维化程度，并改善心脏的舒张功能而减轻MI后的心功能障碍[13]。本实验表明PKD1治疗可减少MI大鼠心肌组织中的TN-C及NF-κB p50的表达。这可能是由于PKD1治疗抑制了TN-C和NF-κB p50激活的炎症信号通路参与的VR。

本研究还显示，PKD1用药组大鼠心肌细胞横截面积、心肌细胞的肥大程度及胶原相关蛋白的含量，尽管较Model组明显改善，但较Sham组仍存在着差异。这表明PKD1用药在抑制心肌肥厚方面的作用是有限的。然而，PKD1用药组大鼠在改善MI大鼠的血流动力学方面却十分显著，几乎接近于Sham组大鼠，而血流动力学指标又是评估心功能的重要指标之一。据此，课题组推测PKD1改善MI后的VR作用除了和一定程度上逆转心肌肥厚有关，同时也可能与PKD1的促血管新生作用密切相关[4-6]。PKD1作用后诱导新的毛细血管生成，可以满足肥厚心肌的血供，而这种肥厚的心肌在保证心肌强有力收缩的同时并不引发心肌缺血。因而，PKD1用药后未完全被抑制的心肌肥厚未必是一种病理性心肌肥厚，有可能是一种生理性肥厚，这对于基于“PKD1”靶点的新药开发提供了一种新的思路。