miR-141-3p对脑胶质瘤细胞生长和Wnt信号通路的影响

江源铭，盛宝英

miRNA是一种单链RNA，其不能编码蛋白质，miR-141-3p编码基因位于14号染色体上，属于miR-200家族，参与肿瘤的发生，其在不同肿瘤组织中的表达水平不同，目前在胶质瘤、胰腺癌、食管癌等肿瘤组织中发现miR-141-3p低表达，而在乳腺癌等肿瘤组织中发现miR-141-3p高表达[1-3]。miR-141-3p参与调控肿瘤细胞的生长，其对于不同的肿瘤细胞作用不同，miR-141-3p可以抑制食管癌等肿瘤细胞的恶性表型[4]。Wnt通路在胶质瘤等肿瘤组织中过度激活，抑制其激活可以逆转肿瘤细胞恶性增殖，从而发挥抗肿瘤作用[5]。该实验探讨miR-141-3p在脑胶质瘤细胞生长凋亡中的作用及机制，为明确miR-141-3p在脑胶质瘤发生中的作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料正常星形胶质细胞HA购自上海基免生物科技有限公司；脑胶质瘤细胞CHG-5、U-87MG、U251购自中国医学科学院肿瘤细胞库；mimics control、miR-141-3p mimics购自南通百奥迈科生物技术有限公司；Lipotectamine2000购自美国 Invitrogen公司；β-连环蛋白(β-catenin)抗体、c-myc抗体、生存蛋白(survivin)抗体和活化型Caspase-3(C-caspase-3)抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 Real-time PCR检测miR-141-3p在胶质瘤细胞中的表达取正常星形胶质细胞HA和脑胶质瘤细胞CHG-5、U-87MG、U251，按照每个25 mm的培养瓶中加入1 ml的TRIzol，置于冰上裂解，期间用移液枪反复吹打，把裂解液转移到离心管内，添加200 μl的氯仿，在室温下孵育3 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。RNA存在上层水相溶液中，收集500 μl上层RNA溶液，加入等体积异丙醇，于4 ℃环境中孵育30 min。离心后，将上清液吸除，添加75%的乙醇洗涤沉淀，干燥后，以DEPC水溶解。取提取的RNA样品，逆转录合成cDNA，进行Real-time PCR，程序为：95 ℃、15 min；95 ℃变性15 s；54 ℃、60s；共50个循环。以2-ΔΔCt法分析miR-141-3p水平，内参为U6。实验重复3次，取均值。

1.3 细胞转染和过表达效果检测取U-87MG细胞，接种到24孔细胞培养板中，按照Lipotectamine 2000说明书将mimics control、miR-141-3p mimics转染至细胞中，转染24 h后，提取细胞中的总RNA，进行Real-time PCR，步骤同上。设置转染mimics control、miR-141-3p mimics后的U-87MG细胞为mimics control组、miR-141-3p mimics组，以只加入脂质体转染试剂Lipotectamine2000的U-87MG细胞为Control组。

1.4 MTT检测细胞增殖按照细胞量为5×104个/ml将Control组、mimics control组、miR-141-3p mimics组细胞接种到96孔板内，继续培养24 h以后，将培养板取出，在每个孔内加入0.5%的MTT溶液，孵育4 h以后，吸弃孔内液体，添加DMSO溶液150μl，结晶溶解以后，检测490 nm的吸光度(A)值，经过空白孔调零以后，分析细胞存活率变化，以Control组细胞存活率为100%，分析mimics control组、miR-141-3p mimics组细胞存活率变化。实验重复3次，取均值。

1.5 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力将Control组、mimics control组、miR-141-3p mimics组细胞分别接种到6孔板内，每个孔中添加3 000个细胞，同时加入2 ml的细胞培养液，继续孵育培养14 d以后，吸弃孔内的上清液，PBS洗涤细胞后添加甲醇溶液固定15 min，用苏木精染色，随机选取5个视野检测细胞克隆形成数目。实验重复3次，取均值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡将培养24 h后的Control组、mimics control组、miR-141-3p mimics组细胞用PBS洗涤3次以后，每组收集106个细胞，添加500 μl的Binding Buffer混合后，分别加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)溶液，混合后，用流式细胞术测定细胞凋亡变化。实验重复3次，取均值。

1.7 Western blot检测β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表达将培养24 h后的Control组、mimics control组、miR-141-3p mimics组细胞用PBS洗涤3次以后，收集细胞，在细胞内加裂解液(按照每个6孔板中添加100 μl裂解液)，在冰上裂解约30 min。收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，分装后，保存于-80 ℃。吸取2 μl的蛋白样品以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测蛋白浓度。蛋白样品同上样缓冲液混匀，于100 ℃煮沸10 min后，每个上样孔加30 μg蛋白样品进行电泳。制胶：常规方法配制10%分离胶，观察其凝固以后，添加5%的浓缩胶。蛋白电泳的起始电压为60 V，观察溴酚蓝进入到分离胶后，将电压调整到100 V继续电泳。转膜：以300 mA电流把凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上，转膜置于冰上进行，时间为1.5 h。封闭：用5%牛血清白蛋白于37 ℃摇床封闭约2 h。把NC膜放在含有1 ∶600稀释的一抗的薄膜抗体孵育袋中，置于4 ℃中过夜。把NC膜放在含有1 ∶3 000稀释的二抗的抗体孵育袋中，于37 ℃孵育2 h。将NC膜置于ECL试剂中发光，收集图像，以β-actin为参照，分析β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3水平。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 miR-141-3p在胶质瘤细胞中低表达脑胶质瘤细胞CHG-5(0.68±0.06)、U-87MG(0.27±0.03)、U251(0.49±0.09)中的miR-141-3p表达水平低于正常星形胶质细胞HA(1.00)，差异有统计学意义(F=91.111，P<0.001)。并且U-87MG细胞中miR-141-3p表达水平低于CHG-5和U251细胞。选用U-87MG细胞做后续实验。

2.2 miR-141-3p mimics提高U-87MG细胞中miR-141-3p表达水平miR-141-3p mimics转染后的U-87MG细胞中miR-141-3表达水平高于没有转染(1.00)及转染mimics control(0.99±0.09)的细胞，差异有统计学意义(F=26.604，P<0.001)。

2.3 miR-141-3p抑制U-87MG细胞增殖、克隆并促进细胞凋亡miR-141-3p过表达后的U-87MG细胞增殖和克隆形成能力降低，细胞凋亡率升高，与没有转染及转染mimics control的细胞比较，差异有统计学意义。见表1、图1。

2.4 过表达miR-141-3p对U-87MG细胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表达水平影响miR-141-3p过表达后的U-87MG细胞中β-catenin、c-myc、survivin蛋白表达水平降低，C-caspase-3 蛋白表达水平升高，与没有转染及转染mimics control组的细胞比较，差异有统计学意义。见图2、表2。

表1 各组U-87MG细胞存活率、克隆形成数目和凋亡率比较

与mimics control组比较：*P<0.05

图1 流式细胞术测定miR-141-3p对U-87MG细胞凋亡影响表2 各组U-87MG细胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表达水平比较

项目Control组mimics control组miR-141-3p mimics组F值P值β-catenin0.89±0.060.90±0.070.45±0.05∗54.027<0.001survivin0.63±0.060.60±0.080.58±0.07∗20.4520.002c-myc0.60±0.050.58±0.070.42±0.03∗10.5540.011C-caspase-30.43±0.040.40±0.060.68±0.04∗31.2790.001

与mimics control组比较：*P<0.05

图2 Western blot分析各组细胞中β-catenin、c-myc、 survivin和C-caspase-3蛋白表达影响1：Control组；2：mimics control组；3：miR-141-3p mimics组

3 讨论

miRNA长度约为15～25 bp，其在人体组织中广泛表达，胚胎发育、组织功能维持等生理过程中几乎均有miRNA的参与，miRNA还参与调控心血管系统疾病、肿瘤等病理过程[6]。miR-141-3p是一种与细胞生长凋亡等密切相关的调控因子，参与调控神经细胞等多种细胞的正常生理功能发挥[7]。miR-141-3p在肿瘤组织中异常表达，其可以作为肿瘤促进因子或肿瘤抑制因子发挥肿瘤细胞生长调控作用，目前在乳腺癌等肿瘤组织中发现miR-141-3p过表达，也有研究显示miR-141-3p在乳腺癌及食管癌组织中低表达，miR-141-3p可能是一种肿瘤抑制因子[8-12]。本实验结果显示，miR-141-3p在胶质瘤细胞中的表达水平低于正常星形胶质细胞，提示miR-141-3p在胶质瘤中可能发挥抗肿瘤作用。

miRNA参与肿瘤发生过程往往与肿瘤细胞的多种生物学特性有关，目前的研究表明，miR-141-3p对于肿瘤细胞的生长、凋亡等具有重要作用，miR-141-3p能够抑制胃癌等肿瘤细胞的生长，而miR-141-3p对于前列腺癌等肿瘤细胞的生长具有促进作用[13]。本次实验研究显示，miR-141-3p过表达后的胶质瘤细胞的增殖和克隆形成能力降低，细胞凋亡增多，细胞中凋亡标志蛋白Caspase-3活化水平升高，miR-141-3p在胶质瘤生长中发挥抑制作用。

Wnt信号通路能够把细胞表面的信号传递至细胞内，其是由β-catenin、c-myc、survivin等组成，其中β-catenin是Wnt信号通路激活的关键，β-catenin也是Wnt信号通路的中心，β-catenin表达水平的高低可以间接反映Wnt信号通路的激活水平；survivin是一个凋亡抑制基因，其具有抑制细胞凋亡的作用，Wnt信号通路激活可以促进survivin表达；c-myc是Wnt信号通路的下游靶基因，也是一种癌基因[14]。很多研究[15]显示，Wnt信号通路在肿瘤中过度激活，抑制其激活可以抑制肿瘤发生和进展。本研究显示，miR-141-3p过表达可以下调胶质瘤细胞中β-catenin、c-myc、survivin的表达水平，miR-141-3p能够负调控Wnt信号，miR-141-3p抑制胶质瘤生长机制可能与Wnt信号通路有关。