自噬相关蛋白Beclin1及IL-18与急性胰腺炎疾病程度的相关性

黄 野，李红昌，毕礼明，陈亚峰，高 磊，潘丽芸，孙文杰，刘 欢，李 劼，奉典旭

关于急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的实验性研究[1-5]表明AP的发生发展与自噬密切相关。自噬相关蛋白Beclin1在自噬过程中起到重要的调控作用[6]。AP治疗领域的研究显示，炎症水平与AP的严重程度密切相关，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-18(interleukin-18,IL-18)等促炎症细胞因子是AP从局部免疫反应发展到全身炎症反应综合征并最终导致死亡的关键因素，IL-18的水平在一定程度上可以代表疾病的炎症程度[7]。

该研究随机收集AP患者，分别为轻型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)以及健康人作为对照。各组留取血液，检测血清淀粉酶((amylase, Amy)、Beclin1及IL-18，同时进行改良CT严重指数评分(modified CT severity index，MCTSI)、急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation,APACHE-Ⅱ)，探讨AP发病时血清Beclin1与IL-18水平以及疾病严重程度关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

1.1.1资料来源 本研究入组者患者，共30例，其中MAP患者10例，SAP患者10例，正常对照10例。入组者采集时间：2013年10月～2015年12月。

1.1.2AP入组标准 参考中华医学会外科分会胰腺外科学组《急性胰腺炎诊治指南(2014)》。符合以下3项特征中的2项可诊断为AP：腹痛 (急性、突发、持续、剧烈的上腹部疼痛，常向背部放射)；血清Amy和(或)脂肪酶活性至少高于正常上限值3 倍；增强电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)/磁共振成像或腹部超声呈AP影像学改变。

本研究入组的AP患者同时符合以下条件：患者发病24 h内进入本研究机构；患者年龄为18～70(43.36±6.32)岁；既往无严重的心、脑、肺、肾、肝等基础疾病。① MAP诊断标准符合AP诊断，不伴有器官功能衰竭及局部或全身并发症。② SAP诊断标准符合AP诊断，有器官功能衰竭，或存在局部或全身并发症。

1.1.3主要的试剂及仪器设备 Beclin1 ELISA检测试剂盒、IL-18 ELISA检测试剂盒购自武汉优尔生(USCN)科技股份有限公司；离心机(Centrifuge 5810)购自德国Eppendorf公司；超低温冰箱(MDF-382E) 购自日本Sanyo公司；64排螺旋CT购自德国西门子公司；自动生化检测仪(INTEGRA 400) 购自上海Cobas公司。

1.2 研究方法

1.2.1研究分组 在符合入组标准的前提下，通过随机数字表法进行分组：① 对照组(Ctr)：无任何基础疾病的健康者。② MAP组：患者符合上述MAP入组标准。③ SAP组：患者符合上述SAP入组标准。

1.2.2标本采集 各组留取静脉血5 ml，AP患者血液系入院后留取，保证在发病24 h内。采集的血液标本常温下静置2 h，高速离心机4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，取上清液，分装入EP管中，放置入﹣80 ℃冰箱内保存。用于检测血清Amy、Beclin1及活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

拷贝AP患者入院24 h内腹部增强CT图片，用于进行腹部CT评分。

1.3 指标检测

1.3.1Amy测定 经本院检验科全自动生化分析仪测定。

1.3.2血清Beclin1测定 采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)法，具体操作步骤按试剂盒说明书逐步进行。

1.3.3血清ROS含量测定 ROS的检测也是采用ELISA试剂盒，具体操作同血清Beclin1的测定方法相同。

1.3.4腹部CT评分 腹部CT评分采用改良的CT严重指数评分(MCTSI)标准，见表1。

表1 MCTSI(修正CT严重指数)评分

MCTSI总分=①+②+③

1.3.5APACHE II评分 根据APACHE II评分表各项检测指标进行评分。APACHE II评分表包含年龄指数、急性生理学评分、慢性健康指数三部分，三部分评分相加分数，反应全身症状，分数越高，病情越严重。

2 结果

2.1 血清Amy、Beclin1、IL-18浓度与Ctr组相比，MAP组和SAP组血清Amy、Beclin1、IL-18浓度均升高(P<0.01)；MAP组与SAP组相比，血清Amy、Beclin1、IL-18浓度差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图1。

2.2 腹部CT及MCTSI、APACHE-Ⅱ评分正常对照者CT轮廓光滑，密度均匀，胰腺周边无渗出，见图2A；MAP患者CT提示胰腺体积轻度增大，胰腺周围脂肪间隙模糊，见图2B；SAP患者CT提示胰腺密度降低，结构紊乱，胰腺周围渗出液明显，多累及腹腔和腹膜后间隙，范围广泛，见图2C。

Ctr组MCTSI、APACHE-Ⅱ评分基本为零，AP发病时MCTSI、APACHE-Ⅱ增高，MAP和SAP与Ctr相比，MCTSI、APACHE-Ⅱ评分增高；并且SAP患者MCTSI、APACHE-Ⅱ评分较MAP患者升高。见表3、图3。

表2 血清Amy、Beclin1、IL-18浓度

与Ctr组比较：**P<0.01；与MAP组比较：##P<0.01

图1 血清Amy、Beclin1、IL-18浓度变化与Ctr组比较：**P<0.01；与MAP组比较：##P<0.01

图2 不同组腹部CT图像A：Ctr组CT图像；B：MAP患者CT图像；C：SAP患者CT图像表3 各组MCTSI、APACHE-Ⅱ评分比较

评分项目Ctr组MAP组SAP组F值腹部CT评分0.060±0.0132.409±0.346∗∗6.862±0.877∗∗##279.4APACHE II评分0.571±0.7874.571±1.134∗∗9.286±1.113∗∗##127.1

与Ctr组比较：**P<0.01；与MAP组比较：##P<0.01

图3 MCTSI、APACHE-Ⅱ评分变化与Ctr组比较：**P<0.01；与MAP组比较：##P<0.01

2.3 血清Beclin1与IL-18浓度的相关性血清Beclin1浓度与血清IL-18浓度做直线相关回归分析可得出y=3 821.960 7x+104.304 5，相关系数为r=0.918 9，P<0.01，提示血清Beclin1与IL-18浓度相关。见图4。

图4 血清Beclin1与IL-18相关性分析

2.4 血清Beclin浓度与MCTSI、APACHE-Ⅱ评分的相关性分析血清Beclin1浓度与MCTSI、APACHE-Ⅱ评分做直线相关回归分析可得出y=10.611 2x-0.596、y=12.980 6x+0.263，相关系数为r=0.977 1、r=0.926 0，P<0.01，提示血清Beclin1浓度与MCTSI、APACHE-Ⅱ评分相关。见图5。

图5 血清Beclin1与MCTSI、APACHE-Ⅱ评分相关性分析

3 讨论

AP临床上起病急、变化快、并发症多，死亡率高，一直是临床上治疗的难点和挑战，及时、准确、高效地对AP患者进行合理诊治尤为重要[8]。明确AP的发病机制是提高其治愈率的根本，大多数研究[9]认为其病理基础系胰蛋白酶原在胰腺细胞内非正常的激活，从而引起胰腺的自我消化，进一步引起局部及全身炎症反应。但胰腺细胞内的酶原具体是如何激活的，目前尚不完全清楚，AP时自噬的改变则是近年新的研究热点。自噬相关信号转导通路错综复杂，自噬相关蛋白Beclin1对自噬的发生和发展有着重要的调节作用[10-11]。正常细胞的生命活动过程中，自噬活动可通过吞噬清除炎性小体的免疫学作用、活性氧以及抑制炎性因子的激活等多个方面进而抑制炎症反应的产生与发展[12]。然而在AP中，自噬受损，炎症因子无法及时清除，进一步引起胰腺细胞受损[13]。其中，炎症因子IL-18与AP的病情进展密切相关[7]。

Mareninova et al[4]通过对分离胰腺细胞、动物模型和人体组织的研究，发现AP时自噬量受损，胰腺腺泡内大量异常自噬空泡堆积；自噬的异常增多是导致酶原激活的诱因，他们认为自噬的病理性改变导致胰腺腺泡细胞空泡的形成以及酶原的激活，最终诱发了AP 的形成。Beclin1是自噬调控的重要分子机制之一，Beclin1的表达和自噬相互促进，血清Beclin1水平的增高可以间接反映AP时自噬的过度激活。这也对临床治疗AP有一定的启示，或许可以通过减少自噬相关蛋白Beclin1的表达而抑制胰腺腺泡细胞自噬的发生，从而减少胰蛋白酶原的激活以及急性胰腺炎时胰腺组织水肿、出血及坏死的发生。

本研究显示，AP患者发病早期血清自噬相关蛋白Beclin1水平升高，并且SAP较MAP血清Beclin1水平增高更明显；Beclin1是自噬形成调控的主要因子之一，这也提示AP的早期伴随着自噬的积聚增多。AP发病时，IL-18产生增多，并且血清Beclin1与IL-18浓度存在有相关性。本研究结果也表明，AP患者MCTSI、APACHE-Ⅱ评分升高较为明显，并在一定程度上能反映疾病的严重程度；在对血清Beclin1浓度和MCTSI、APACHE-Ⅱ评分进行相关性分析，发现二者有相关性。

综上所述，本实验结果提示：AP患者发病早期，炎症水平升高，炎症因子血清IL-18与血清Beclin1水平正相关，并且血清Beclin1水平与疾病严重程度指标MCTSI、APACHE-Ⅱ评分成正相关，因此对血清Beclin1水平的检测可能是评估预测AP严重程度的一个较为有效的指标。在本次实验的基础上，进一步明确二者之间具体关系，可能会为评估预测AP严重程度，提供更为有力的证据。