背根神经节内GABA重摄取改变在神经痛发生发展中的作用

让 凌，谢晓芳，冉 然，薛 锐，肖 昀，郑 飞，唐俊明

神经痛在临床上很常见，如糖尿病性神经痛、带状疱疹后神经痛等，因发生机制尚不清楚，尚缺乏有效的治疗手段[1]。神经系统的敏感性升高是神经痛的重要发生机制[2-3]。γ-氨基丁酸(γ-aninobutyrate，GABA)重摄取是释放入突触内的GABA作用被终止的主要方式，其通过GABA转运蛋白(GABA transporter，GAT)将释放入突触内的GABA转运入神经元胞体或胶质细胞内，从而终止GABA的作用，改变神经系统的兴奋性[4]。研究[5]已经证实，背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)内有GAT3的表达，但神经损伤后GAT3是否发生改变，这些改变是否和神经痛的发生有关，目前还没有研究涉及。该研究探讨了大鼠坐骨神经慢性束缚损伤(chronic constriction injury，CCI)模型上GAT3的改变，并且运用DRG局部注射技术，将GAT3抑制剂注射在DRG局部，探讨其对神经痛症状的影响，旨在为神经痛的发病机制和治疗寻找新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量170～220 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，动物饲养室温为(22±2)℃，湿度40%～70%，12 h昼夜交替，自由进食水。所有实验方案经湖北医药学院动物保护和使用委员会批准，按照国际疼痛研究协会的指导原则进行。

1.2 CCI模型参照以往文献[6-7]，动物水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射后在右大腿中部切开皮肤，钝性分离股二头肌，暴露坐骨神经干，于坐骨神经分支近端处用4/0#羊肠线在坐骨神经上间隔1 mm做4个松结扎，结扎强度以大腿产生1个小的短暂性抽搐为宜，然后逐层缝合。术后单独饲养，12 h明暗交替光照，行为学测定确定神经痛造模成功。

1.3 Western blot动物用水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中保存，经RIPA裂解液(武汉Antgene公司)裂解，离心收集蛋白，用BCA试剂盒测蛋白浓度。每个加样孔30 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE凝胶电泳后, 转移到PVDF膜上。用TBS配制的5%脱脂奶粉低速摇床封闭1 h。4 ℃下一抗孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后加入辣根过氧化酶显色剂显色，Bio Rad蛋白成像仪成像, 用Image J软件测灰度值进行半定量分析。所使用的抗体包括： α-Tubulin(小鼠抗大鼠，抗体稀释比1 ∶1 000,美国Sigma公司)、GAT3一抗(兔抗大鼠，抗体稀释比1 ∶750，美国Abcam公司)；GAT3二抗(山羊抗兔，抗体稀释比1 ∶10 000)、内参二抗(山羊抗小鼠，抗体稀释比1 ∶10 000，美国Jackson公司)。

1.4 RT-PCR动物用水合氯醛(30～40 mg/kg，ip)麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中研磨， TRIzol法提取总RNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，行分光光度计检测RNA浓度，并逆转录为cDNA，按SYBR PremixEx Ⅱ法行实时定量PCR反应，检测GAT3的表达。引物序列见表1。以GAPDH为内参，使用公式2-ΔΔCt计算mRNA的差异倍数。

表1 引物序列

1.5 L5DRG局部置管参照文献[8]方法，动物经水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在大鼠背部L4-L6右侧旁开0.5 cm处，切开背部皮肤，钝性分离皮下组织和椎旁肌肉，暴露L5椎板，在椎间孔内2 mm处钻1个0.8 mm的孔，将预制的套管插入孔内2 mm，骨水泥固定，连接PE 10聚丙烯管，切口缝合。术后将大鼠分别安置在装有木屑地板的塑料笼子中，自由摄食和饮水，每次实验前动物适应环境至少24 h。

1.6 大鼠后爪热痛阈测定参照文献[8]方法，用大鼠爪痛觉检测仪(意大利UGO公司)测定大鼠后爪热痛阈。将大鼠放在玻璃笼器内，待大鼠适应安静后，将光源对准大鼠后足掌心，打开光源开关并自动开始计时，直到大鼠因疼痛出现缩足反射，计时结束，此时记录的时间为后爪热痛缩退反应潜伏期(paw withdrawal lantency, PWL)。为防止皮肤灼伤，设置最大强度55%，保护时间为25 s。测量5次，每次间隔10 min，取均值，即为大鼠热痛阈值。

2 结果

2.1 CCI对大鼠痛阈的影响SD大鼠分为假手术组(Sham组，n=6)和CCI组(n=6)，CCI组动物实施坐骨神经结扎，Sham组动物暴露坐骨神经，但不做结扎；与Sham组比较，术后第1天开始，CCI组大鼠PWL出现显著降低(F=57.296,P<0.05)，这个改变持续到术后7 d。见图1。

图1 CCI对大鼠痛阈的影响与Sham组比较：*P<0.05

2.2 CCI对大鼠DRG内GAT3蛋白和mRNA表达的影响与Sham组比较，CCI组DRG 内GAT3蛋白在术后第3天有所增加(t=3.719,P<0.05)，见图2。与Sham组比较，CCI术后DRG内GAT3 mRNA表达明显增加(t=5.369,P<0.05)，见图3。

图2 CCI术后第3天DRG内GAT3的表达变化与Sham组比较：*P<0.05

图3 DRG内GAT3 mRNA表达变化与Sham组比较：*P<0.05

2.3 L5DRG局部注射GAT3抑制剂SNAP5114对大鼠痛阈的影响SD大鼠12只，预先置入导管并实施CCI手术，随机分为CCI组(n=6)和SNAP5114治疗组(SNAP组，n=6)，在第3天分别通过导管给CCI组大鼠注射溶剂DMSO(10 μl)，给SNAP组大鼠GAT3抑制剂[(S)-1-[2-[三(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-3-哌啶甲酸((S)-1-[2-[tris(4-methoxyphenyl)methoxy] ethyl]-3-piperidinecarboxylic acid，SNAP5114)(200 μg, 10 μl)，分别于注射前、注射后30、60、120 min、24 h、48 h测双侧后爪热痛阈值PWL，对比双侧后爪PWL。CCI组注射DMSO后大鼠后爪痛阈值没有明显改变(P>0.05)。与CCI组(0.369±0.151)比较，SNAP组(0.779±0.095)DRG局部注射SNAP5114 120 min后，患侧后爪热痛阈值明显上升(F=10.822,P<0.05)，持续至注射后24 h[CCI组：(0.616±0.0501)，SNAP组：(0.859±0.017)；F=42.939，P<0.05]。见图4。DRG局部注射SNAP5114后120 min，患侧后爪热痛阈值明显上升，持续至注射后24 h；箭头表示注射时间。

图4 L5 DRG局部注射GAT3抑制剂SNAP5114对大鼠痛阈的影响与CCI组比较：*P<0.05

3 讨论

本研究采用CCI神经痛模型，CCI 损伤后大鼠表现为自发痛(自发抬起损伤肢体，时而舔足、咬足或甩足，避免损伤侧的负重)、痛觉过敏(机械痛敏和热痛敏)[6-9]。本研究中，与Sham组比较，CCI模型组的大鼠在术后1 d热痛阈值明显下降，表现为热痛敏，并持续到术后7 d，说明造模成功。

因为突触间隙中GABA不能被酶分解，所以突触中GABA清除需要GAT的再摄取[10-11]，GAT位于神经元和星形胶质细胞的质膜上，这些转运蛋白将胞外GABA转运到细胞内。在中枢神经系统中，与疼痛有关的主要有GAT1和GAT3[10]。先前研究[12]显示用角叉菜胶注射诱发神经痛后，三叉神经脊束核的三叉神经元GAT3表达增加，并认为这种GAT3表达增加减少了脊髓三叉神经元突触内GABA的作用时间，导致GABA作用的减弱，从而引起神经系统致敏。但也有研究[5]报道神经痛动物GAT3表达下降，在紫杉醇诱发的神经痛模型中，脊髓背角星形胶质细胞中GAT3的表达是减少的。还有研究[13-15]表明，GAT3在病理状态下后功能发生改变，出现逆转运，介导了GABA从神经突触末梢向突触内的逆向释放，这种逆向释放代偿了神经损伤后GABA作用的减弱，因此GAT3表达减少会导致神经痛的发生。总之，神经痛动物中GAT3的改变还存在争议。而本研究结果显示，与Sham组比较，术后第3天DRG内GAT3蛋白以及GAT3 mRNA均有所增加，进一步在DRG局部使用GAT3抑制剂后，CCI大鼠的痛阈值明显升高，出现神经痛的症状的缓解。这可能是神经损伤后GAT3的表达增加加速了神经突触中GABA清除，从而使突触中GABA浓度降低，作用时间缩短，GABA能抑制信号减弱，导致机体痛觉过敏，是神经痛的发生机制。本研究只探讨了GAT3量的改变，GAT3的功能是否在神经损伤后发生改变需要进一步的研究证实。

为特异性的研究L5DRG局部GAT3在神经病理性疼痛发生发展中的作用，术前给予大鼠L5DRG局部置管，排除管子脱落、麻醉等因素影响，在术后第3天通过导管将GAT3抑制剂SNAP5114局部注射在DRG附近，减少了SNAP5114吸收入血或入脑脊液产生副作用。结果表明，注射后24 h大鼠的疼痛有所缓解，提示抑制GAT3对大鼠神经病理痛有一定的镇痛作用。但连续测定显示，疼痛缓解的持续时间不长，注射后48 h和对照组痛阈无明显差异，说明L5DRG内GAT3表达的升高可能并非神经痛发病的主要因素，GAT3升高可能是神经痛其他原发病因导致的结果，需要进一步探讨。

综上所述，神经损伤后DRG内GAT3表达明显升高，DRG局部给予GAT3抑制剂可短暂缓解神经痛的症状，L5DRG内GAT3表达升高并非神经痛发病的主要因素。