外周血循环肿瘤细胞联合细胞角蛋白19片段21-1检测在非小细胞肺癌筛查中的应用价值

官燕飞，陈健锋，袁 斌，刘 君，陈 昂，袁春雷，童辉纯，陈志强

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占全部肺癌的85%，5年生存率仅为16.10%，位居全球恶性肿瘤死亡率的榜首[1]。2015年中国NSCLC发病例数约50万，同年，死亡的NSCLC病例则达到40万，严重危害人们生命安全[2]。究其主因是缺乏有效的早期诊断方法，NSCLC确诊时70%～80%均为中晚期。国内外学者研究数据证实：I期NSCLC患者5年生存率可达60%～70%，而IV期肺癌生存率则不到5%[3-4]。开展早期筛查是降低NSCLC相关死亡率、显著提高其5年生存率的关键。但是目前尚无公认的NSCLC早期筛查最佳模式。因此，寻找诊断效能高的NSCLC早期筛查方法显得非常紧迫。该研究通过检测肺部健康组、良性组及恶性组患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)和细胞角蛋白19片段21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21-1)水平，比较CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在三组的阳性率差异及诊断NSCLC的效能差异，综合评估CTC、CYFRA21-1单独或联合诊断NSCLC的价值，为探讨一种无创而便捷、敏感又特异的NSCLC筛查手段提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料临床回顾并通过随机数字表选取2017年2月～2018年10月中山市博爱医院、中山大学肿瘤防治中心的172例肺部健康体检者(健康组)、156例肺部良性病变患者(良性组)、118例NSCLC患者(恶性组)作为研究对象。患者均为原发性肺部病变或肿瘤，未合并其他肿瘤。健康组：男98例，女74例，年龄16.9～86.3(40.6±6.9)岁；良性组：男88例，女68例，年龄21.5～78.9(41.8±5.8)岁；恶性组男68例，女50例，年龄34.6～81.5(42.5±6.3)岁。三组之间的年龄及性别构成比差异均无统计学意义(P>0.05)。

NSCLC的入选参照《2015 版WHO肺部肿瘤组织学分类标准》执行，包括：腺癌、鳞癌、腺鳞癌、大细胞肺癌[5]。NSCLC的TNM分期参照国际肺癌研究协会(IASLC)2017年第8版分期执行，包括：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期[6]。良性组：包括肺良性肿瘤、肺尘埃沉着病、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肺炎等良性病变患者。抽取三组研究病例的静脉血液标本并检测CTC与CYFRA21-1水平。CTC和CYFRA21-1联合检测采用的是平行试验，其判断标准为：两个检测结果中只要有一个结果为阳性即诊断为阳性；反之，只有两个结果均为阴性才诊断为阴性。本研究经我院医学伦理委员会审查通过，获得研究对象的知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1主要试剂及仪器 COBAS E601全自动化学发光分析仪及CYFRA21-1检测试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，CTC分离富集、检测试剂盒及PathfinderTM CYTTEL READER and ANALYZER全自动扫描图像分析系统购自莱尔生物医药科技有限公司。

1.2.2CYFRA21-1检测及判定标准 采用电化学发光方法检测CYFRA21-1水平，质控品检测值在设定的范围内。参考试剂说明书及相关文献[7]，CYFRA21限值为3.3 ng/ml。CYFRA21≥3.3 ng/ml，提示CYFRA21检查结果异常。本研究中定为阳性；CYFRA21<3.3 ng/ml，CYFRA21检查结果正常，本研究中定为阴性。

1.2.3CTC分离富集、检测及判定标准 阴性富集CTC技术基于免疫学原理，借助免疫磁微粒技术，通过逐步去除血液中的血浆、红细胞、白细胞等成分，实现血液中CTC的富集。imFISH CTC鉴别技术，将基因水平的FISH技术和蛋白水平的免疫荧光染色技术结合，建立的兼具细胞形态和核遗传变异的精准CTC鉴别方法。操作流程及判定标准，参考试剂盒及相关文献[8]：抽取研究对象的静脉血，ACD抗凝，混匀，血浆分离、红细胞裂解、白细胞去除、涂片干燥、免疫荧光染色、镜下观察。将细胞核内探针信号>2个，无血源性白细胞表面抗原(红色)阳性的细胞定为CTC。CTC数目≥2个的患者定为CTC阳性患者。

1.3 统计学处理使用SPSS 22.0软件进行分析。CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在三组的阳性率差异及诊断NSCLC的效能(灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值)差异的比较采用χ2检验。总体差异检验水准取α=0.05。三组间进一步做两两比较时检验水准α′=0.02(0.05/3)。TNM分期的I到Ⅳ期间进一步做两两比较时检验标水准α″=0.008(0.05/6)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者八号染色体(CEP8)探针信号表达情况荧光显微镜下显示，NSCLC患者CEP8探针信号从0-1个(非CTC，亚二倍体)，2个(二倍体)，3到数个(CTC，超二倍体)不等，染色体数量具有多样性。图1中蓝色部分为细胞核DAPI染色，橙色部分为探针所在位置。

图1 NSCLC患者八号染色体(CEP8)探针信号表达情况 ×400

A：未检测到探针信号(CEP8信号缺失)；B：仅检测到1个探针信号(CEP8信号缺失)；C：检测到2个探针信号(二倍体)；D：NSCLC患者CTC(三倍体)；E：NSCLC患者CTC(四倍体)；F：NSCLC患者CTC(五倍体)

2.2 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在三组研究对象中阳性率的差异CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在肺部健康组、良性组与恶性组的阳性率差异均具有统计学意义(P<0.05)，阳性率均在恶性组中最高。进一步做两两比较，与健康组与良性组比较，差异均有统计学意义(P<0.02)。见表1。

表1 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在三组研究对象中阳性率的比较[n(%)]

2.3 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在恶性组各TNM分期中阳性率的比较CTC检测阳性率在恶性组的各TNM分期中差异具有统计学意义(χ2=9.18，P=0.03)，CTC的阳性率跟恶性组TNM分期相关，随着分期的增加而增加，在Ⅳ期中最高。CYFRA21-1、CTC联合CYFRA21-1检测的阳性率，在不同的TNM分期比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，跟TNM分期无关。见表2。

2.4 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测诊断NSCLC的效能比较CTC、CYFRA21-1单独或联合检测诊断NSCLC灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值总体差异均具有统计学意义(P<0.05)。灵敏度最高的是CTC联合CYFRA21-1检测法，与CTC、CYFRA21-1单独检测差异均具有统计学意义(P<0.02)。特异度最高的是CTC检测法，与CYFRA21-1、联合检测差异均具有统计学意义(P<0.02)。符合率最高的是CTC检测法，与CYFRA21-1检测差异具有统计学意义(P<0.02)。阳性预测值最高的是CTC检测法，与CYFRA21-1、联合检测差异均具有统计学意义(P<0.02)。阴性预测值最高的是CTC联合CYFRA21-1检测法，与CYFRA21-1检测差异具有统计学意义(P<0.02)。约登指数最大的是CTC联合CYFRA21-1检测法(达到0.864 5)。见表3。

3 讨论

目前NSCLC早期筛查方法是：低剂量CT扫描(LDCT)筛查和血液分子标志物的检测。研究[9]表明：与普通X线比较，对NSCLC的高危人群进行LDCT筛查可使其死亡率下降20.3%。而传统肿瘤标志物对早期NSCLC的筛查敏感性和特异性较低[10]。因此，传统的NSCLC筛查方案也许警示研究人员另辟蹊径建立一种更为高效的筛查模式显得日益迫切。

研究[11]证实：CTC的出现可能更优先于影像学能发现更微小病灶。研究[12-13]表明： CYFRA21-1对早期NSCLC辅助诊断中具有一定的临床意义。但是，CTC联合CYFRA21-1检测诊断NSCLC的价值，尚未见报道。

本研究结果显示CTC、CYFRA21-1、CTC与CYFRA21-1联合检测跟肺部病变程度紧密相关。至于研究中CTC出现于肺部良性病变患者中，可能是肺部良性病变(如慢性阻塞性肺疾病患者)发生后，机体处于一种应急状态，血液中出现了CTC。而CYFRA21-1出现在实验的良性组患者中，与Holdenrieder et al[14]研究报道的急性肺炎、肺结核患者中该指标明显升高，容易影响诊断实验特异性的结论基本一致。

表2 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在恶性组各TNM分期中阳性率的比较

表3 CTC、CYFRA21-1单独或联合检测诊断NSCLC的效能比较

本研究通过CTC、CYFRA21-1单独或联合检测在恶性组各TNM分期中阳性率的比较，可得出一个结论：CTC的阳性率跟恶性组TNM分期是紧密相关的，这一发现可能有助于病情的治疗与预后，进而提高NSCLC的生存率。

本研究通过CTC、CYFRA21-1单独或联合检测诊断NSCLC的效能比较，结果显示，CTC作为一种新型的无创性检测手段，在区分NSCLC与肺部良性病变，预测恶性组的TNM分期，诊断NSCLC中均有较好的作用。但是，CTC与CYFRA21-1联合检测能表现出更佳的综合性能，可能更有助于减少NSCLC的误诊和漏诊，因而建议在临床诊疗中进行联合检测实用价值更高。

荧光显微镜下NSCLC患者CEP8探针信号从0～1个(非CTC)，3到多倍体(CTC)不等。之所以出现这一实验结果可能跟NSCLC患者肿瘤的基因突变发生方式有关，正常细胞是以染色体二倍体的形式出现(如图1C)。但是，部分患者发生基因的缺失突变后，染色体畸变为一条甚至为零，图1A和图1B即为亚二倍体。而另外部分患者则发生了染色体数目的变化，增加了一条或者数条，图1D、1E、1F即为超二倍体。总之，当细胞发生异常改变，肿瘤细胞基因发生突变，细胞DNA含量增高或者减低，染色体可以出现三倍体、四倍体，甚至是多倍体。也可以出现染色体丢失的变化。而这种染色体异倍体变化常常优先于肿物的出现。因此，染色体CTC的检测，有助于对癌变的肿瘤作出早期诊断。

综上所述， CTC和CYFRA21-1联合检测与单独检测相比，在NSCLC筛查及分期中拥有较高的综合性能。这一结论与肿瘤的多因素、多步骤的发生机制吻合。本研究从CTC(染色体角度)和CYFRA21-1(肿瘤标志物角度)两个不同角度进行联合检测，效果高于单个角度。

本研究尽管受到研究时限及样本容量的限制，初步得到了联合检测对NSCLC筛查及临床分期较有价值的实验研究结论。后续的研究中我们将在扩大样本容量的同时，进一步深入探讨CTC与CYFRA21-1联合检测与NSCLC的耐药性、转移复发、疗效评估、生存评估等的相关性，或许能对NSCLC的生物学行为及肿瘤机制有更深刻的理解，能进一步促进NSCLC的精准治疗，有效地提高NSCLC患者生存率。