深绿短肠蕨抗氧化、降糖、抗炎活性研究
2019-10-15孙倩倩李红锐陈毅坚高利斌蒋孟圆李育逵黄相中孙静贤
孙倩倩,李红锐,陈毅坚,高利斌,蒋孟圆,李育逵,黄相中,孙静贤
(云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室,云南 昆明 650500)
深绿短肠蕨Allantodiaviridissima为蹄盖蕨科短肠蕨属的蕨类植物.其根状茎粗壮,斜升或者直立,鳞片膜质,褐色或深褐色,叶簇生;该种主要分布于台湾、广西、四川、云南和西藏等地,常见于阔叶林下和林下缘沟溪水边;海拔400~2 200 m;其拳卷嫩叶可做野菜食用,偶在云南西部及西北部的农村集市出售[1].
植物多酚(plantployphenols)是一类主要由黄酮类、酚类、鞣质类等结构组成且广泛存在于植物体内的多羟基酚类次级代谢产物[2].多酚类结构在临床有普遍应用,具有抗衰老、抑菌、抗炎、抗病毒、降糖等生物活性,且对恶性肿瘤、心脑血管等多种疾病有良好的治疗或预防作用[3].
目前尚无对深绿短肠蕨化学成分及药理活性方面的报道,但蹄盖蕨属有抗肿瘤、抑菌、抗病毒,抗氧化等作用[4].本研究对深绿短肠蕨根状茎提取物的多酚含量进行了测试,对其抗氧化,抗炎和降糖活性进行研究,希望为其今后的开发和利用提供理论参考基础和方法依据.
1 实验材料
1.1 样品材料
本实验所用植物来源于云南省新平县,经由云南大学陆树刚教授鉴定为Allantodiaviridissima(Christ) Ching,标本现存放于云南民族大学,民族医药学院(标本编号为:20170410).
1. 2 实验试剂与材料
2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(南京大唐化工);1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH),2, 2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)二氨盐(ABTS)(合肥博美生物科技有限责任公司);没食子酸(西安沃森生物工程有限公司);福林酚试剂(上海展云化工有限公司);内毒素又称脂多糖( lipopolysaccharide,LPS 美国 Sigma 公司);RAW264.7细胞(昆明动物研究所);DMEM培养基高糖、胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT),青霉素和链霉素(南通凯恒生物科技发展有限公司);一氧化氮合成酶抑制剂(L-NMMA),一氧化氮检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);阿卡波糖片(拜耳医药保健有限公司);分析纯:无水乙醇,碳酸钠(山东德彦化工有限公司);磷酸二氢钾、氢氧化钠、石油醚、乙酸乙酯,正丁醇(常州市中超化工有限公司).
1.3 实验仪器与设备
CWKF-100多功能粉粹机(永康市艾泽拉电器有限公司);HH-US恒温水浴锅(青岛聚创);SHB-IV双A型双面循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DLSB-低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司); N-1100D-WD旋转蒸发仪(上海增森);MS-TS电子分析天平(上海恒刚);多功能全波长酶标仪(上海闪谱生物科技);722 V-1 500紫外-可见分光光度计(上海美析仪器有限公司).
2 实验步骤
2.1 制备深绿短肠蕨提取物
取20.0 g深绿短肠蕨根状茎粉末,用无水乙醇回流浸提数小时,合并滤液,用减压蒸馏法得乙醇提取物(AVH).取适量AVH先用石油醚萃取若干次,至上清液无色澄清,回收下层液体,将收集的上清液减压蒸馏得石油醚萃取物(AVP).同理,依次用乙酸乙酯溶剂、正丁醇溶剂萃取回收下层溶剂,萃取物依次命名为乙酸乙酯萃取物(AVE),正丁醇萃取物(AVB).
2.2 总酚含量的测定
2.2.1 绘制没食子酸标准曲线
操作方法及步骤如下[5-9]:
A:将没食子酸标准品加水配制成质量浓度为0.05 μg/mL的标准储备液;
B:标准系列溶液的配制:分别量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL标准没食子酸储备液加蒸馏水定容即得;
C:取标准储备液1.0 mL放置于比色管中,依次加入福林酚试剂0.3 mL,20%碳酸钠溶液1.5 mL,加水定容至10 mL,充分摇匀混合,室温下静止放置25 min.
对照组:空白试剂,吸光度波长:760 nm;标准曲线纵坐标:吸光度(A),横坐标:没食子酸溶液质量浓度(ρ,μg/mL).
2.2.2 样品中总酚含量的测定
操作方法及步骤如下:
A:取AVH稀释为1.0 mg/mL的实验用待测溶液,取1.0 mL放置比色管中;
B:方法同标准曲线的绘制,依据标准曲线回归方程计算深绿短肠蕨AVH中多酚含量[5-10];结果表示为:没食子酸当量mg /提取物g.
2.3 抗氧化活性测定
2.3.1 DPPH 法分析样品对自由基的清除能力
操作方法及步骤如下:
A:0.2 mmol/L DPPH溶液用时现配, 4 ℃避光保存;
B:取适量AVH、AVP、AVE、AVB,加入定量无水乙醇,将提取物稀释至所需不同质量浓度(范围在6.3~100.0 μg/mL);
C:分别取2.0 mL AVH、AVP、AVE、AVB不同浓度的深绿短肠蕨提取物稀释液,加入装有2.0 mL DPPH现配溶液的试管中,同时分别加入2.0 mL无水乙醇,混匀;
D:将混合液于避光条件下中先静置30 min,后测定517 nm处的吸光值,重复操作3次,取平均值,以VC作阳性对照[5,11-13].
DPPH自由基清除率S(%)的计算公式为:
其中As为 2.0 mL提取物溶液 + 2.0 mL DPPH溶液的吸光度;Ar为 2.0 mL无水乙醇 + 2.0 mL提取物溶液的吸光度;A0为2.0 mL无水乙醇 + 2.0 mL DPPH溶液的吸光度.
2.3.2 对ABTS+自由基清除能力的测定
操作方法及步骤如下[5,14-15]:
A:ABTS+实验储备液,由无水乙醇稀释所得,测定734 nm波长处的吸光度A0: 0.70±0.02;
B:取2.5 mL ABTS+溶液,依次加入0.5 mL不同浓度的深绿短肠蕨的不同溶剂提取物,0.5 mL VC溶液,充分混合,静止放置10 min,测定734 nm处测定的吸光度,记为As;
C:测定样品ABTS+自由基清除能力,将VC作为阳性对照组,进行吸光度测定,重复此方法及步骤3次,结果取平均值;
清除率S(%)计算公式为:
其中A0为0.5 mL无水乙醇+2.5 mL ABTS溶液的吸光值;As为0.5 mL提取物溶液+2.5 mL ABTS溶液的吸光值
2.4 乙醇提取物体外降糖活性测定
实验采用96板孔法,操作方法及步骤如下[5-16]:
A:设置以下4组,分别为:样品对照组、样品组、酶空白组、酶活性组,每组分别设3个复孔,将总体积设为150 μL,并加缓冲液补充使总体积相等;
B: 分别向各管中加入LPS 50 μL 、提取物溶液10 μL,α-葡萄糖苷酶20 μL, 37 ℃,反应5 min;
C:分别向各管中加入20 μL底物(4-硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷),37 ℃,反应15 min;
D:加入50 μL 0.2 mol/L 的碳酸钠溶液,停止反应;在400 nm 波长处测定吸光度(A). 实验以阿卡波糖作为阳性对照.
样品对酶活性的抑制率(%)按如下公式计算:
其中A样品:20 μLα-葡萄糖苷酶+20 μL底物+适量磷酸缓冲盐溶液+10 μL粗提物稀释液的吸光度;A样品对照:适量磷酸缓冲盐溶液+10 μL提取物稀释液的吸光度;A酶活性:适量磷酸缓冲盐溶液+10 μL DMSO +20 μLα-葡萄糖苷酶+20 μL底物的吸光度;A酶空白:20 μL阿卡波糖溶液+10 μL DMSO+适量磷酸缓冲盐溶液的吸光度.
2.5 乙醇提取物体外抗炎活性的测定
2.5.1 RAW264.7细胞培养
在37 ℃、5%CO2条件下,用含有10%小牛血清、青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L)的DMEM培养基培养RAW264.7细胞,待细胞生长至对数期,备用.
2.5.2 细胞存活率检测
MTT法检[17]测细胞存活率,操作方法及步骤如下.
A:在96孔培养板上接种对数期生长的RAW264.7细胞,细胞密度调整至约5×108个/L,每组10孔,每孔体积100 μL,37 ℃,5%CO2条件下培养24 h;
B:加入不同质量浓度的AVH稀释液(50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL),每个质量浓度设置3个复孔,培养24 h;
C:向各孔加MTT溶液(质量浓度为5 mg/mL)20 μL,培养4 h;
D: 将各孔上清液去掉,并向各孔加入DMSO溶液150 μL,避光条件下振荡15 min,用酶标仪测定波长为490 nm处的 OD值.
按公式计算细胞相对增殖率(RGR).
细胞相对增殖率(%)= (实验组光吸收值-空白组光吸收值)/(对照组光吸收值-空白组光吸收值)×100%.
2.5.3 不同体积分数乙醇提取物抑制NO释放的检测
操作方法及步骤如下:
A:在96孔板上接种对数期生长的RAW264.7细胞,将细胞密度调整为5×10 8 个/L,100 μL每孔,37 ℃,5%CO2条件培养24 h;
B:加入质量浓度为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的AVH,其中每一质量浓度设3个复孔,每孔50 μL;
C:阳性对照组L-NMMA,用药剂量终浓度为50、25、12.5、6.25、3.13 μmol;
D:每孔加50μL LPS溶液(终质量浓度为2 μg/mL),37 ℃、5%CO2条件下培养24 h,取上清培养液测定NO浓度;
E:取70 μL细胞培养液,依次加入50 μL GriessⅠ,50 μL GriessⅡ试剂,在540 nm波长处测其吸光度.
3 结果与讨论
3.1 多酚含量的检测结果
标准曲线如图1所示,没食子酸在0.5~5.0 μg/mL 浓度范围内,与浓度正相关.其中线性回归方程A=0.012 7+0.004 83x,相关系数R2=0.999 0,横坐标为没食子酸质量浓度(μg/mL),纵坐标为760 nm波长处的吸光度(A).
将没食子酸标准溶液用1.0 mL、1.0 mg/mL的AVH稀释液替换,测得760 nm处的吸光度A,重复3次,根据线性回归方程计算得到提取物中多酚含量为:(172.8±0.7) 没食子酸mg /提取物g,约占提取物总量的17.3%.
3.2 抗氧化活性的测定
3.2.1 清除DPPH自由基的作用
如图2所示,在等质量浓度下,深绿短肠蕨AVH、AVP、AVE,AVB各溶剂萃取物对DPPH自由基均表现出不同程度的清除作用,且呈现浓度依赖趋势.各溶剂萃取物清除DPPH自由基的能力大小依次为:VC >AVE>AVH>AVB>AVP,其中EC50值越小,表示清除自由基的能力越强,即抗氧化能力越强.经origin程序拟合运算得出VC、AVE、AVH、AVB的EC50值分别为:15.7、16.2、26.7、48.3 μg/mL.当提取物的质量浓度为100.0 μg/mL时,AVE部分对DPPH自由基的清除率最高,可达93.4%,AVE部分对自由基的清除能力近似阳性对照组.
3.2.2 对ABTS+自由基的清除作用
从图3 可以看出,不同溶剂萃取部分在0.0~100.0 μg/mL的浓度范围内,清除ABTS+的能力大小与浓度呈现正相关,且深绿短肠蕨AVE萃取部分在低浓度时清除ABTS+自由基的能力强于阳性对照组.深绿短肠蕨各部分提取物对ABTS+自由基清除能力的大小依次为:AVE>AVH>AVB>AVP,其中EC50值越小,表示清除自由基的能力越强,即抗氧化能力越强.经origin程序拟合运算得出AVE、AVH、AVB的EC50值分别为22.3、29.6、58.7 μg/mL.当提取物的质量浓度为100.0 μg/mL时,AVE萃取部分对清除ABTS+能力最强,可达94.7%,其清除能力与阳性对照组相当.
3.3 体外降糖活性作用
AVH降糖活性的测定采用体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法,结果见图4.由图4可知,阳性对照组阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值为(104.7±7.9)μg/mL,而AVH的IC50值为(48.9±5.6)μg/mL,明显高于阳性对照组;因为α-葡萄糖苷酶活性是降糖能力的重要指标,对其抑制作用明显,则降糖效果较好.因此AVH具有良好的体外降糖活性能.
3.4 抗炎活性作用
NO作为一种重要的炎症因子,是评价炎症反应的重要指标.本研究中NO浓度越高,则样品对NO炎症因子的抑制作用越差,从而评价各样品的抗炎活性.与 LPS 应激模型组相比,不同浓度的AVH均具有不同程度抑制NO分泌的活性,且NO的释放水平随着AVH浓度的增加不断减少,呈浓度依赖关系.####与空白比较,P<0.000 1;****与LPS组比较,P<0.000 1;***与LPS组比较,P<0.001;*与LPS组比较,P<0.05;L-NMMA的浓度为12.5 μg/mL.当AVH的质量浓度为50 μg/mL时,与LPS组比较,其对NO的释放具有较强的抑制作用(P<0.000 1).说明AVH具有一定的抗炎活性.
4 结果与讨论
植物多酚是由黄酮类、酚类、鞣质类等结构组成的次生代谢产物,具有抗衰老、抑菌、抗炎、抗病毒、降糖等生物活性,本研究中深绿短肠蕨中多酚类化合物含量为(172.8±0.7)mg 没食子酸/g提取物,约为17.3%左右,其多酚含量较高.深绿短肠蕨不同溶剂提取物均有一定的抗氧化活性且呈量效关系,其中,乙酸乙酯萃取部分对清除DPPH和ABTS+能力均为最强,其IC50分别为16.2、22.3 μg/mL,均优于其他溶剂萃取部分.与阿卡波糖对比,深绿短肠蕨乙醇提取物有明显的抑制α-葡萄糖苷酶活性,其IC50为(48.9±5.6)μg/mL,表明其有较好的降糖作用.体外抗炎试验表明,深绿短肠蕨能明显抑制炎症因子(NO)的释放,当深绿短肠蕨乙醇提取物的浓度为50 μg/mL时,炎症因子的释放到达最低值3.91 μmol/L,表明其具有较强的抗炎作用.
深绿短肠蕨乙酸乙酯萃取部分有显著的抗氧化活性,其乙醇提取物有明显的降糖和抗炎活性,但活性部分仍为混合物,成分也比较复杂,很难具体到某个单一化合物去评价深绿短肠蕨的药理活性.今后可通过梯度洗脱,分子筛选等分离纯化方法处理提取物,进一步明确活性高的单体化合物结构,为深绿短肠蕨进一步开发成为天然的抗氧化剂、降糖、抗炎药物奠定基础,也为今后研究该属其他植物提供研究思路.