细胞遗传学综合性实验的设计与实践

李 楠， 郭海滨， 李亚娟， 劳媚媚

(华南农业大学 公共基础课实验教学中心，广州 510642)

0 引 言

遗传学是探究生物遗传和变异规律的理论科学，是生命科学领域的基础学科，研究内容丰富，小到基因结构、功能及表达，大到生物群落的遗传特征[1]。遗传学理论与实践关系密切，实验不仅是遗传学的重要基础，更是培养创新能力的重要环节[2]。刘向东等[3]结合国外“混合式学习”方法，提出了适合华南农业大学农科类专业的“创新型混合教学模式”遗传学教学改革法。2009年，根据现代农业的需要，构建了四模块、三层次、二整合和一方案的实验内容和教学体系，探索出一套适合现代农学专业创新性实验教学体系[4-5]。将依附理论课的实验剥离，实现实验教学的独立设课，2014年农学院实践教学大纲中，遗传学实验从8学时和16学时的验证性实验内容拓展到32学时、48学时和64学时综合性、研究性实验内容。突出了综合性实验对培养创新人才的重要性，推动了综合性实验的设计与应用。

综合性实验的设计思路主要来源于3方面：① 探索验证性实验间的共通性，提升为综合性实验，如经典遗传学综合性实验。② 将科研项目成果(包括前沿的研究内容、新颖的材料与方法、科学的研究结果等)与实验教学结合，提炼出综合性实验，如分子遗传学综合性实验(包括DNA提取、PCR、电泳等)、基因工程实验。③ 将大学生创新性实验项目与实验教学结合，利用其研究周期短、研究内容不深、研究方法创新等优势，设计综合性实验项目。2012年至今，依托公共基础课实验教学中心立项的国家、省、校级创新训练项目有83项，其中结合老师科研项目的有51项，结合实践教学的有21项，该实验的设计思路则来源于此。通过实验教学证明，综合性实验在培养学生的综合能力、创新能力及研究能力上发挥了重要的作用[6]。

1 秋水仙素对洋葱根尖细胞有丝分裂影响实验设计

1.1 实验目的

(1) 掌握生物显微镜操作技能，显微图像拍摄与统计分析系统使用技巧，有丝分裂制片技术。

(2) 学习人工诱导植物组织染色体变异方法和方差分析法。

(3) 掌握有丝分裂动态变化过程及染色体结构变异、数目变异等特征。

(4) 了解秋水仙素对植物遗传与变异的影响，激发学生深入思考其他诱变剂(如重金属、污水、洗涤剂等)对植物遗传与变异的影响，开展下一步研究性实验设计。

1.2 实验原理

有丝分裂是真核生物细胞分裂的基本形式，各种生长旺盛的植物组织，如根尖、茎尖、愈伤组织等常进行着活跃的体细胞有丝分裂。有丝分裂可划分为前期、中期、后期和末期。有丝分裂进程中，在一些因素的影响下(如物理因素、化学药剂)，会干扰分裂进程，出现缺失、重复、倒位、易位及染色体数目增减等变异类型。并在以后的细胞分裂过程中产生一些异常的细胞学现象和特殊的遗传学效应。如：缺失环、重复环、后期染色体桥、断片、微核及加倍等[7]。

秋水仙素是一种常用诱变剂，是从百合科秋水仙属的秋水仙(ColchicumautumnaleL.)器官和种子内提炼出来的一种植物碱。能阻止分裂细胞形成纺锤丝，使复制后的染色单体无法移向两极，细胞不分裂，进而实现染色体加倍[8-9]。自1937年美国学者布莱克斯利等用秋水仙碱加倍成功曼陀罗的染色体后，秋水仙碱就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种中[10]。研究表明秋水仙素对实验材料适当处理后，会影响细胞有丝分裂指数并诱发染色体结构变异，出现断片、微核、双核、后期桥、加倍等变异特征[11-12]。

1.3 实验材料、试剂与仪器

实验材料：洋葱(2n=16)，购自农贸市场。

实验试剂：秋水仙素,用蒸馏水配制成 0.1%秋水仙素溶液;卡诺固定液,无水酒精∶醋酸=3∶1;改良苯酚品红,1 mL苯酚品红+9 mL 45%冰醋酸+0.1 g山梨醇;盐酸1 mol/L。

实验仪器：恒温生化培养箱(宁波莱福科技有限公司，PQX-330A-12HM)、显微镜(奥林帕斯，CX31)、水浴锅。

1.4 实验方法

1.4.1 洋葱发根与诱导方法

洋葱发根：取新鲜洋葱鳞茎，剥去外层干枯鳞片，切去残余老根，将鳞茎盘浸泡于蒸馏水中，于25 ℃培养箱中培养48 h，当不定根长出2 cm时备用。

诱导方法：以蒸馏水(CK)为对照，将不定根置于蒸馏水和0.1%浓度秋水仙素溶液中浸泡22 h后，于10 am取出，放入固定液中固定24 h，再经95%、80%乙醇中各停留30 min后，于70%的乙醇中保存备用。

1.4.2 有丝分裂制片技术

解离：取固定后的洋葱根尖置于1 mol/L HCl溶液中60 ℃水浴13 min，再经蒸馏水反复浸泡3次，每次停留5 min。

制片：放1～2个根尖在载片上，用镊子将根尖敲至浆状。再用卡宝品红染色液染色3～5 min，盖片，用橡皮在盖玻片上轻轻敲匀使细胞分散均匀，最后置于光学显微镜下观察。

1.4.3 实验要求与数据分析

在两组对比实验中，要求每人每组实验处理至少3个洋葱，根尖数在60条左右。

(1) 统计对照组与处理组的洋葱根尖膨大率。

(2) 观察有丝分裂动态变化过程及染色体结构变异、数目变异等细胞特征，并作图。

(3) 每组实验材料至少制作10张观察片，利用显微图像拍摄与统计分析系统，记录每张观察片1 000细胞中处于有丝分裂各时期、后期桥、微核及加倍的细胞数目，利用方差分析法对比两组实验的有丝分裂指数和细胞染色体变异率，得出结论。

(4) 讨论秋水仙素对洋葱根尖细胞有丝分裂影响。

变异细胞鉴别标准。微核鉴别①存在时相：微核在完整的分裂期细胞中，形态为圆形或椭圆；②体积：直径小于主核的20%；③与主核的关系：与主核完全脱离；④染色：染色与主核完全一致。桥鉴别①存在时相：桥必须在完整的后期细胞中，形态为细胞两端着丝粒共同牵引着一条染色体；②染色：染色与其他染色体完全一致。

数据分析：有丝分裂指数=分裂细胞数/观察细胞总数；变异率=该类畸变细胞数/观察细胞总数。

1.5 实验结果与讨论

(1) 洋葱根尖膨大率统计。观察两组实验中洋葱根尖的外观形态变化，记录根尖膨大率，初步了解秋水仙素对植物外观形态的影响。实验结果表明，经秋水仙素溶液处理后洋葱根尖膨大率较高，可达85%～95%。

主要仪器：Qubit® 2.0荧光计(Invitrogen Q32866)，凝胶成像系统(美国UVP)，PCR 仪(Eppendorf，T100TM Thermal Cyeler)，电泳仪电源（北京市六一仪器厂，DYY-6C型），台式离心机（Thermo Fisher，Pico-21）。

(2) 观察有丝分裂染色体动态变化过程及染色体结构变异、数目变异等细胞特征，并作图如图1、2所示。

1.间期

2.前期

3.中期

4.后期

5.末期

1.间期微核

2.后期染色体桥

3.中期加倍

(3) 利用方差分析法比较两组实验的有丝分裂指数和细胞染色体变异率，得出如图3所示结论。

图3 秋水仙素溶液对洋葱根尖细胞分裂指数和变异率的影响

由图3可知，秋水仙素有促进细胞有丝分裂的能力。以蒸馏水(CK)为对照，实验表明洋葱根尖细胞经秋水仙素溶液处理后处于前期、中期及分裂期的细胞指数明显增加，均达到显著或极显著差异。尤其处于中期的细胞，与对照相比，达极显著差异，表明秋水仙素具有促进细胞染色体停滞在中期的能力，这一实验结果与前人研究一致[8-9]。

秋水仙素对洋葱根尖细胞染色体有畸变效应。经秋水仙素溶液处理后，有丝分裂细胞中后期桥的变异率为0.31%，微核的变异率为0.43%，加倍的变异率为0.86%，与对照均达到极显著差异。表明秋水仙素有诱导染色体产生后期桥、微核、加倍等变异现象。

通过实验观察与数据分析，因秋水仙素有促进细胞有丝分裂能力和诱导染色体产生畸变效应，进而致使洋葱根尖从外观形态上表现出膨大特征。说明部分化学试剂对植物遗传有影响，进而影响植物外观形态、生长发育，甚至威胁生命健康。

2 综合性实验的实践体会

2.1 验证性实验与综合性实验优势互补

验证性实验在实践教学中已运用多年，在印证理论知识上有着不可替代性作用，是学生实验的入门基础，可规范和培养学生的基本实验技能[13]。综合性实验则是在验证性实验基础上的提升，旨在提高学生综合应用知识的能力、创新能力及研究能力。该细胞遗传学综合性实验利用了对比的方法，融合了验证性实验和综合性实验内容，实现了两者的优势互补。

2.2 传授式教学与问题引导式教学相结合

在结构变异验证性实验教学中，因实验材料、诱导剂、诱导方式、变异率、学生操作、课堂时间等综合因素的影响，致课堂中只有部分学生可观察到结构变异现象，且观察的变异类型少。针对该问题，老师与学生进行深入探讨，激发学生思考。部分学生会利用大学生创新训练项目、毕业论文等形式，在老师指导下开展研究，如绿茶对植物染色体变异的抑制作用研究、秋水仙素诱导洋葱根尖染色体结构变异研究、植物根尖微核及染色体畸变技术研究等。

老师将学生的研究成果与实验教学结合，总结提炼出该细胞遗传学综合性实验。教学过程中采用了传授式教学法与问题引导式教学法相结合[14]，提出秋水仙素对洋葱根尖细胞有丝分裂有怎样影响的问题，并结合理论教学讲授有丝分裂验证性实验原理及方法，提供相关参考文献资料。学生结合问题和学习资料，设计实验，开展综合性实验研究。并在综合性实验基础上，老师进一步引导式提问，如是否有感兴趣的实验材料？是否想了解秋水仙素或是其他诱变剂对该材料的影响？是否想了解环境污染与植物遗传的关系？等，引导学生发散思维，进行创新型实验设计。

2.3 开展创新研究性实验，自我提升综合能力

在整个实验过程中学生的主观能动性非常重要，一方面需要学习合理利用经费和时间，购置实验用品，安排研究进程，保证实验的顺利完成；另一方面需要发挥团队合力，拓展遗传学及相关学科的理论和实践知识，并将其运用于实验研究中解决困难，最终实现自我创新能力、科研能力、综合能力的提升。

2.4 改进实验材料，提升观察效果

以前结构变异诱导与鉴定实验一直以伽玛射线(吸收剂量为31.0～40.0 Gy)辐照大葱小孢子母细胞产生结构变异作为实验材料，但该材料的教学应用效果并不理想。微核的诱导率为0.21%，后期桥的诱导率为0.11%。从每年上课反馈的数据分析，使用大葱幼花材料，每班仅20%左右的同学观察到“微核”现象，观察到“后期桥”现象的少于10%。

自从以秋水仙素诱导洋葱根尖细胞产生结构变异作为实验材料后，微核的诱导率达0.43%，后期桥的诱导率达0.31%。平均每班通过实验操作观察到细胞分裂相的学生达90%以上，观察到微核的达84%，观察到“后期桥”现象的达55%，观察到染色体加倍等异常现象的达59%(见表1、2)。相较大葱幼花实验材料，有更多学生观察到染色体结构变异现象，在教学应用中取得了很好的观察效果。

表1 遗传学实验室2016年本科遗传学实验教学情况汇总表

表2 学生观察到各种染色体结构变异现象的人数统计

另外，秋水仙素诱导洋葱根尖细胞产生的变异类型多，如不均等分裂、多核、断片、染色体数目上的各种变异等[15]。这些现象会引起学生探究的兴趣，触发学生与老师交流，实现老师与学生共同学习和研究的目的。

3 结 语

该细胞遗传学系列实验采用了“验证性-综合设计性-创新研究性实验”的多层次、研究性实验教学方式，对提高学生的综合能力、创新能力及研究能力有显著效果。验证性实验、综合性实验、研究性实验属于科学实验的方法，是层层递进的关系，在培养学生综合创新能力上发挥着不可替代性作用。验证性实验是学生进入科学研究领域前的基石，旨在让学生掌握实验的基本技能，老师对学生的教学方式，主要以面对面的传授式教学法。在适当时机以问题引导的教学方式，激发学生思考，顺利进入综合性实验研究。综合性实验是学生进入科研研究领域前的传送带，旨在激发学生研究的兴趣，学习研究的基本方法。老师对学生的教学方式，需根据综合性实验的特点，采用组合式教学法，如传授式、问题引导式、翻转课堂式、专题式、自主研究式、分组合作式、讨论分析式等[16-17]。研究性实验是学生进入科学研究领域的缩影，旨在让学生了解科学研究的过程、问题及方法，进而培养学生独立研究、团队合作、创新思维及解决问题的能力[18]。老师对学生的教学方式，是以学生为主体，老师作为学习团队中的一员，扮演建议者、引导者、鼓励者的角色。实验教学改革中，一直摸索着如何在有限的教学时空里，融合这三者的优势，配以行之有效的教学方法，实现创新型、研究型人才的培养。