羧甲基石墨烯-精胺用于抗卵巢癌的研究

朝呼和，徐长远，张西锋*

(1.首都医科大学附属北京妇产医院中心实验室，北京 100026；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023)

卵巢癌已经成为威胁人类健康的主要疾病之一，其治疗难度大，致死率高，给人类生活带来严重的负面影响。随着纳米药物的出现以及高速发展，纳米药物也逐渐被人们熟知。纳米材料是指在三维空间中的材料其至少有一维是纳米级别，尺寸在0.1～100 nm之间[1-2]。石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料，具有优异的光学、电学、力学特性，在材料学、微纳加工、能源等方面具有重要的应用前景，被认为是一种未来革命性的材料[3-4]。此外，在生物学领域也开始研究石墨烯的应用，除了已经提到的物理和化学性质之外，纳米材料具有优良的生物学特性，如可用于抗菌、生物传感技术、细胞成像和药物传递，以及抗癌活性。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯羧甲基化后即得到羧甲基石墨烯，在此基础上我们合成了羧甲基石墨烯-精胺(CGS)。CGS具有可调控的微纳结构和宏观形态；CGS可抑制Skov3细胞的增殖，引起细胞内活化氧(ROS)的表达量的增加，并诱导细胞的线粒体膜电位降低。此为CGS用于生殖系统疾病的治疗奠定了良好的基础。本研究利用卵巢癌细胞模型，借助傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜X射线衍射和原子力显微镜等检测手段，研究CGS的抗肿瘤活性。

材料与方法

一、材料和设备

本实验所用羧甲基石墨烯-精胺(CGS)为本实验合成。S-3000N扫描电子显微镜(SEM)购自日本日立公司，X射线粉末衍射仪(XRD)购自美国布鲁克公司，傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)购自美国PE公司，原子力显微镜(AFM)购自美国Asylum Research公司。噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自北京博润莱特科技；ROS测定试剂盒购自南京迈博生物科技；线粒体膜电位检测(JC-1)试剂盒购自北京索莱宝科技；卵巢癌细胞(Skov3)购自上海富衡生物科技有限公司。

二、方法

1.CGS样品的FTIR、SEM、XRD和AFM检测：CGS样品的FTIR、SEM、XRD和AFM表征分析检测方法按照各操作规程要求进行。

2.细胞的培养、MTT检测、JC-1和ROS分析：卵巢癌细胞(Skov3)培养于含10%胎牛血清(Gibco，上海江林生物科技)和1%双抗的DMEM/F12培养基(Gibco，上海江林生物科技)，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。MTT检测、ROS检测和JC-1检测等参照试剂盒说明书的检测方法，并参考相关文献[5-7]。

3.CGS液的配制：称取0.01 g的CGS粉末，溶解于100 ml细胞培养基(10%胎牛血清+1%双抗的DMEM/F12)中并超声处理5 min，即配置成浓度为100 μg/ml的CGS液，然后再用细胞培养基(10%胎牛血清+1%双抗的DMEM/F12)分别稀释为20、40、60和80 μg/ml各浓度的CGS液。对照组为CGS浓度为0 μg/ml。

三、统计学分析

采用SPSS 22.0中文版统计软件进行数据分析。本研究中所得到的数据至少重复3次，并采用均数±标准差的形式呈现，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CGS的FTIR光谱分析

FTIR检测结果显示，在3 415.42 cm-1、1 629.37 cm-1、1 402.08 cm-1、1 058.39 cm-1位置有CGS吸收峰，在3 415.42 cm-1吸收峰是由于N-H的伸缩振动，在1 629.37 cm-1吸收峰处为-COOH的伸缩振动吸收峰。这表明羧甲基已成功引入到石墨烯上，1 402.08 cm-1吸收峰为C-H的弯曲振动，1 058.39 cm-1为C-O-C键的不对称伸缩振动吸收峰(图1)。

图1 CGS的FTIR光谱分析结果

二、CGS的XRD光谱分析

图2是CGS的XRD表征图谱，图中CGS在10.6°时有且只有一个峰，表明CGS复合纳米材料中没有其他杂质。

图2 CGS的XRD图谱

三、CGS的SEM成像分析

从图3可以看到，CGS随机的分散沉积在石墨烯上，并且石墨烯层与层之间分布着CGS，整体呈波浪形。

图3 CGS的SEM结果

四、CGS的AFM成像分析

图4是典型的使用水分散后均匀涂在玻璃表面得到的CGS图片，由此图可以测量CGS的AFM的平均宽度，得到的结果是A-B为87.61 nm。

五、MTT法检测细胞活力

以卵巢癌细胞Skov3为细胞模型来评估CGS的细胞毒性。结果显示，随着药物浓度的升高，Skov3细胞活性随之下降。CGS的处理浓度为20、40、60、80、100 μg/ml处理24 h后，Skov3细胞的活性相比于对照组分别下降到81%、82%、77%、75%和66%，100 μg/ml时最为显著(P<0.05)。但100 μg/ml浓度处理48 h与24 h相比较，细胞活性变化不显著(P>0.05)(图5)。CGS处理组对Skov3细胞活力有抑制作用，并有着浓度依赖性。

六、ROS检测

结果显示，Skov3细胞经过CGS处理24 h后，DCF的荧光强度随给药浓度升高而增强，提示ROS随给药浓度升高而提高(图6)。在80和100 μg/ml处理组，ROS的水平分别是0 μg/m处理组的100倍和252倍(P<0.01)。CGS会造成ROS水平的升高，提示CGS具有一定的细胞毒性。

图4 CGS的AFM图及统计结果

与浓度0 μg/ml组相比较，**P<0.01

七、JC-1检测膜电位变化

Skov3细胞经过CGS(80 μg/ml)处理24 h后，加入JC-1来测定线粒体膜电位(MMP)。图7中可以看到与对照组相比，CGS组的红色荧光显著减弱，绿色荧光显著增强，可知JC-1单体逐渐增加而JC-1聚集体逐渐减弱，说明处理组细胞MMP去极化严重。

A：ROS检测细胞图片(×200)，0、20、40、60、80和100为CGS的浓度(μg/ml)；B：荧光强度分析；与浓度0 μg/ml组相比较，**P<0.01

图7 JC-1的检测结果

讨论

卵巢癌是一种女性生殖道恶性肿瘤中发病率和致死率最高的肿瘤，严重威胁着女性的生命健康。目前，常用的疗法主要包括手术、激素治疗、化疗、放疗、免疫疗法和靶向治疗。纳米级药物及其载药系统在肿瘤治疗中的应用逐渐引起关注。石墨烯及其复合物以其独有的特性，已广泛用于癌症的诊断和治疗。利用石墨烯将光转化为电能的特性，用于刺激活细胞，从而在不伤害健康细胞的情况下，达到杀死癌细胞的目的[8]。癌细胞与正常人体细胞活跃程度不同，利用石墨烯与之接触会发生不同程度的变化，可用于早期癌症的无创诊断[9]。利用石墨烯制备的纳米传感器，同样可以用于肺癌早期诊断[10]。经聚乙烯亚胺修饰的石墨烯具有稳定的荧光成像，并增强了对癌细胞的光热和细胞毒性活性[11]。氧化石墨烯与纳米银形成的纳米复合物(rGO-Ag)可以抑制卵巢癌细胞Skov3的增殖，引起胞内ROS的增高和核内DNA修复，诱导细胞凋亡[12]。

本研究通过FTIR检测技术发现CGS吸收峰在3 415.42 cm-1、1 629.37 cm-1、1 402.08 cm-1、1 058.39 cm-1有4处吸收峰。XRD图谱表明，CGS在10.6°时有且只有一个峰，表明CGS复合纳米材料中没有其它杂质。SEM表明相邻的石墨烯层被隔开，有很好的分散性。AFM展示了良好分散的CGS形态学特征，进一步证实了这些颗粒的粒径大约分布在87 nm左右。由此表明CGS具有良好的特性。CGS通过影响卵巢癌Skov3细胞的细胞活力，抑制卵巢癌Skov3细胞的增殖，且CGS的抑制能力有一定的浓度依赖性。线粒体是细胞中参与能量转换的重要细胞器，线粒体功能是否正常直接影响到细胞的活性，线粒体膜电位的变化可以反映线粒体的功能[13-14]。CGS处理组细胞去极化严重，ROS普遍存在于细胞中。正常细胞中ROS的产生和代谢处于一个平衡状态，当细胞中ROS的水平上升，会激活相应的信号通路，产生细胞损伤、诱导细胞凋亡[15-17]。本研究中，CGS引起ROS水平升高，提示CGS对癌细胞具有较好的细胞毒性作用，CGS具有诱导癌细胞死亡的活性。因此，CGS具有可调控的微纳结构和宏观形态；CGS可抑制Skov3细胞的增殖，引起细胞内ROS的表达量的增加，并诱导细胞的线粒体膜电位降低。此为CGS用于生殖系统疾病的治疗奠定了良好的基础。