UPLC-MS/MS检测生鲜牛奶中72种抗生素残留
2019-10-15王承平侯蓓蓓虞成华
王承平 - 秦 宇 侯蓓蓓 -雷 涛 虞成华 - 葛 宇
(1. 上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2. 国家食品质量监督检验中心，上海 200233)
牛奶是人们日常生活中需经常消费的食品。近年来，抗生素残留问题日益突出，而牛奶中抗生素残留主要来源于兽医临诊及畜牧生产中的大量使用[1]。其中一部分违禁抗生素被违禁应用于动物饲料添加剂中[2]，或是使用抗生素来预防动物疾病且促进动物快速增长[3]，或是在休药期违法使用抗生素而造成抗生素残留[4]。
牛奶中的抗生素残留可能产生以下危害[5]：① 对人体的危害，包括导致人体免疫力下降、降低药物对人体的治疗作用、使人体慢性中毒、导致基因突变等；② 对生态环境的危害，包括造成环境污染、破坏微生物种群平衡、增加耐药菌种等。因此，建立牛奶中的抗生素多残留检测方法已成为保障食品安全的迫切需求。而多残留检测方法的关键是前处理中的提取和净化。目前报道的牛乳中抗生素残留的净化方法有直接法[6]、QuEChERS法[7]、固相萃取法[8]及免疫固相萃取法[9]等。
试验拟建立一套超高效液相色谱—串联质谱法测定生鲜牛奶中72种抗生素残留的方法，并对200批次生鲜牛奶进行检测，为生鲜牛奶中抗生素残留的检测提供新的快速检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜牛奶：抽检样品；
甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷：色谱纯，美国Thermo公司；
甲酸：色谱纯，美国ACS色谱试剂公司；
乙二胺四乙酸二钠：纯度≥99.0%，国药集团化学试剂有限公司；
Oasis®PRiME HLB：3 mL/60 mg，美国Waters公司；
24种喹诺酮类抗生素混合标准溶液(100 mg/L)、10种青霉素类抗生素混合标准溶液(100 mg/L)、20种磺胺类抗生素混合标准溶液(100 mg/L)、12种头孢类抗生素混合标准溶液(100 mg/L)、氨苄西林、苯唑西林标准品：纯度均≥98%，美国A ChemTek Inc公司；
9种四环素标准品：纯度≥98%，德国Dr Ehrenstorfer公司。
1.2 仪器与设备
三重四极杆串联质谱仪：TQ-XS型，带电喷雾离子源(ESI)，美国Waters公司；
液相色谱系统：AcquityH®UPLC CLASS型，美国Waters公司；
电子天平：MSZO 204S型，瑞士MettlerToleo公司；
高速离心机：Centrifuge 5804型，德国Eppendorf公司；
多管涡旋振荡器：D-91126型，德国Heidolph公司；
快速溶剂蒸发仪：EZ-2.3 Elite型，英国Genevac公司；
超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司。
1.3 样品前处理
1.3.1 提取 称取5.00 g试样于50 mL塑料离心管中，涡旋2 min，加入10 μL甲酸及20.0 mL乙腈[考察溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、EDTA-2Na—乙腈溶液、1.5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液和5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液]，涡旋3 min，超声15 min，加2 g氯化钠，涡旋2 min，9 000 r/min离心3 min，收集上清液，残渣再次加入10.0 mL乙腈重复上述操作，合并两次上清液于另一离心管中，混合均匀，40 ℃下氮气吹干待净化。
1.3.2 净化 取氮气吹干的离心管，加入定容液(乙腈∶水=1∶3，体积比)5.0 mL，超声2 min，加入乙腈饱和的正己烷10.0 mL，涡旋混合2 min，9 000 r/min离心1 min，收集下层清液，使其全部通过Oasis PRiME HLB柱(使用前无需活化平衡处理)并收集于另一离心管中，流速2～3 mL/min，再次涡旋混合后，取适量混合液过0.22 μm PTFE滤膜，供液相色谱串联—质谱/质谱仪测试。
1.3.3 基质加标标准工作曲线的制备 将混合标准工作液，用定容液逐级稀释成5.0～100.0 μg/L标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品5.00 g，加入标准系列溶液1.0 mL，其余操作同1.3.1、1.3.2。
1.3.4 加标回收试验 取空白鲜奶样品，添加混合标准溶液，进行总数为96批次(4基质×6平行×4批次，为期1月)的加标回收率试验。
1.4 LC-MS/MS条件
1.4.1 液相色谱条件 色谱柱Atlantis®T3柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温30 ℃，进样体积2 μL，流动相A为0.1%(体积分数)甲酸—水溶液，流动相B为乙腈，流速0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～2 min，5% B；2～7 min，5%～95% B；7～8 min，95% B；8～8.1 min，95%～5% B；8.1～10 min，5% B。
1.4.2 质谱条件 多反应监测(MRM)，电喷雾正离子模式(ESI+)；毛细管电压3.00 kV；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气流速1 000 L/h；反吹气流速150 L/h；碰撞气流速0.15 mL/min。
1.4.3 质谱参数的优化 将5类混合标准溶液分别注入质谱仪中，对去簇电压(Cone)、碰撞能量(CE)进行优化，选取相对丰度较高的两对多反应监测(MRM)离子对作为定量离子和定性离子。
1.5 数据处理
使用MassLynx®软件对每个化合物的定量离子进行数据处理以得到样品溶液浓度数据，并使用定性离子进行辅助定性。然后计算样品含量、精密度、回收率数据。
2 结果与分析
2.1 色谱、质谱条件优化
2.1.1 色谱柱的选择 通过比较分析，选择可在宽pH条件下使用且对极性化合物有较好分离效果的Waters Atlantis T3色谱柱，并选择柱长50 mm、粒径1.7 μm的UPLC型号，分离检测72种抗生素残留单次运行时间为10 min。
2.1.2 流动相的选择及洗脱梯度的优化 通过比较水—甲醇、水—乙腈、0.1%(体积分数)甲酸—甲醇、0.1%(体积分数)甲酸—乙腈4种流动相组合的分离效果，发现乙腈相对于甲醇的峰形更好，色谱柱反压更低，保留时间更稳定；而在ESI+模式下，0.1%(体积分数)甲酸相对于水能提供更多地离子化所需的H+，从而明显增强化合物的响应，提高检测灵敏度。因此，最终选择0.1%(体积分数)甲酸—乙腈作为流动相，并优化了洗脱梯度，所有化合物均得到了较好地分离并具有良好的峰形。5类抗生素代表化合物的MRM色谱图见图1。
图1 5类抗生素代表化合物MRM色谱图
2.2 提取溶剂的优化
牛乳中含有蛋白质、脂肪、乳糖等较多分析干扰物，试验重点考察了沉淀蛋白的方式对多种抗生素提取效果的影响。由图2可知，当使用1.5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液为提取溶剂时，多数化合物能实现有效提取，回收率较好，达74.3%；但随甲酸浓度的增加，化合物提取效率呈下降趋势，可能是甲酸浓度改变了部分化合物的带电状态，降低了其在乙腈中的溶解效率。因此，选择1.5%(体积分数)甲酸—乙腈为提取溶剂。
2.3 净化方法的优化
试验发现，当使用10 mL1.5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液进行蛋白沉淀后，提取液呈澄清状，由于免疫固相萃取柱具有一定的专一性，比较了直接法进样、市售QuEChERS净化包及两种固相萃取柱(HLB和Oasis®PRiME HLB)的净化效果。结果表明，QuEChERS净化包不适用于生鲜牛奶的化合物净化，主要为部分化合物无回收。相比直接进样法，固相萃取方式适用于生鲜牛奶中的抗生素残留分析，对减少基质效应有较为明显的影响，综合试验成本及效率，选择无需活化处理的Oasis®PRiME HLB柱进行净化处理试验。
1. 二氯甲烷 2. 甲醇 3. 乙酸乙酯 4. 乙腈 5. 1.5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液 6. 5%(体积分数)甲酸—乙腈溶液 7. EDTA-2Na—乙腈溶液
图2 7种提取溶剂下72种抗生素在牛奶基质中的平均回收率
Figure 2 Average recovery of 72 antibiotics in milk matrix in 7 extraction solvents
2.4 方法学评价
2.4.1 线性关系、检出限及定量限 试验表明，72种抗生素在1.0～100.0 μg/L浓度范围内均线性良好。线性相关系数(R2)在0.960 0～0.999 9。以定量离子信噪比S/N=3计算化合物的检出限(LOD)，5种化合物LOD为10.0 μg/kg，15种化合物LOD为5.0 μg/kg，其余52种化合物LOD≤2.5 μg/kg。
2.4.2 精密度与回收率 试验发现，72种抗生素的加标回收率在低、中、高3个水平下分别为74.0%～118.8%，63.8%～122.6%，43.9%～139.7%；相对标准偏差分别为1.37%～29.61%，1.79%～30.27%，6.03%～39.70%。
2.5 实际样品检测
通过试验发现，共检出2批次阳性样品，分别为氯甲硝咪唑5.76 μg/kg，替米考星6.83 μg/kg。目前，中国关于氯甲硝咪唑的禁限量标准尚未建立。试验建立的方法可对市售产品进行有效监管，在检测时间及简单易行上具有优势，可用于生鲜牛奶中抗生素残留的快速检测。
3 结论
综合考虑生鲜牛奶基质的特点及5类抗生素的理化性质，对仪器条件和前处理方法进行了优化，建立了一套可用于快速检测生鲜牛奶中72种抗生素的快速前处理—超高效液相色谱—串联质谱方法，在低、中、高3个加标水平下的回收率为40%～140%，且保留时间稳定，定性准确。该方法灵敏度高，检测时间较少，方法简便，对生鲜牛奶中抗生素的检测具有较高的参考价值。后续将增加可检测抗生素的类别及种类，尽量覆盖所有的有可能造成危害的抗生素。
