土霉素完全抗原的制备及ELISA检测方法的建立

曹金博 - 胡骁飞 - 王 耀 李燕虹 - 曹夕丹 -邢云瑞 - 孙亚宁 - 邓瑞广 - 张改平,3 -,3

(1. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2. 河南科技大学食品与生物工程学院， 河南 洛阳 471003；3. 河南农业大学，河南 郑州 450000)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)属于四环素类抗生素中的一种，其化学结构式如图1所示[1]。由于具有广谱抗菌性，且价格低廉，因此被广泛用于禽畜各种感染性疾病的治疗，适量添加在动物饲料或饮水中还可有助于禽畜生长和疾病预防[2-3]。但由于禽畜养殖过程中长期、大量违规添加四环素类抗生素，导致其在动物源性食品以及环境中过量残留，对人类健康造成极大威胁[4-5]。中国农业部235号公告明确规定：牛奶和肌肉中四环素类抗生素最高残留量不得超过100 μg/g，肾脏、肝脏、蛋中分别不得超过600，300，200 μg/g。

图1 OTC分子结构式

目前，高效液相色谱法、气相色谱—质谱法等检测方法存在仪器昂贵、操作繁琐、检测不及时等局限，因而不适合样品的现场筛查[6-8]。相比之下，酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫层析试纸(Immunochromatographic assay，ICA)等免疫学快速检测方法操作简单、迅速，同样具有良好的灵敏度和特异性，在大批量样品现场筛查方面具有显著优势[9-11]。该类方法依赖高效抗体对抗原进行灵敏特异识别，但土霉素分子量小，无免疫原性，必需与载体蛋白偶联制备完全抗原才能刺激机体免疫应答产生抗体。目前，关于OTC完全抗原的制备虽有报道[12]，但所获得多抗血清的敏感性和特异性有待提高。试验拟采用重氮化法和碳二亚胺法合成OTC完全抗原，制备并鉴定OTC多抗血清，以期为后期制备OTC单克隆抗体及建立免疫学快速检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TC)、沙拉沙星(SARA)、环丙氨嗪(CA)等标准品：纯度≥99%，美国Sigma公司；

1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、对氨基苯甲酸：纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA):纯度≥99%，美国Sigma公司；

氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平：ME204E型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV-5100H型，美国Thermo Fisher公司；

电泳仪：DYY-6C型，大连捷迈科贸有限公司；

凝胶成像仪：ChemiDocTMXRS+型，美国Bio-Rad公司；

傅立叶变换红外光谱仪：NicoletTMiSTM5型，日本岛津公司。

1.1.3 试验动物

BALB/c小鼠：6周龄SPF级，济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 方法

1.2.1 OTC半抗原合成与鉴定 OTC半抗原合成路线图见图2。参照Fleeker等[13]的重氮化法，具体操作步骤为：称取4.3 mg对氨基苯甲酸溶于4 ℃预冷的2 mL 0.2 mol/L的稀盐酸溶液中，称取4.0 mg NaNO2溶于1 mL 4 ℃预冷的双蒸水后缓慢滴加到对氨基苯甲酸溶液中，4 ℃避光反应1 h。称取10 mg OTC溶于2 mL 4 ℃预冷的四硼酸钠缓冲液(pH 8.5)，将上述反应液缓慢滴加到该溶液中，4 ℃避光搅拌2 h，反应液呈深红色，用6 mol/L 的浓盐酸调节其pH至1.5以下，室温静置10 min，产生沉淀，5 000 r/min离心3 min，去除上清，用4 ℃预冷的双蒸水洗4遍，真空冷冻干燥后取部分样品进行红外扫描鉴定。

1.2.2 OTC完全抗原合成 采用同样的方法合成免疫原OTC-BSA和包被原OTC-OVA，其合成路线(以OTC-BSA为例)见图3。具体操作步骤为：称取OTC半抗原5 mg溶于1 mL PBS中，加入1.8 mg NHS，4 ℃避光反应2 h。称取6.5 mg BSA溶于2 mL PBS后慢滴加到上述反应液中，同时加入3 mg EDC，4 ℃避光搅拌24 h。最后在4 ℃条件下用PBS搅拌透析3 d，离心去除沉淀得OTC完全抗原。

1.2.3 OTC完全抗原鉴定

(1) 紫外扫描鉴定：用PBS配制与完全抗原溶液浓度一致的BSA溶液和OTC标品溶液，用紫外—可见分光光度计分别扫描其在220～350 nm的吸收光谱，通过对比各溶液的特征吸收峰判断偶联效果[14]。

(2) 红外扫描鉴定：将OTC完全抗原溶液真空冷冻干燥，对OTC完全抗原、BSA和OTC进行红外扫描，以扫描波数为横坐标，透过率为纵坐标，得到红外扫描光谱并进行对比。

图2 OTC半抗原合成路线

图3 OTC-BSA合成路线图

(3) SDS-PAGE鉴定：参照文献[15]制得12%的分离胶和5%的浓缩胶，其电压分别为60，90 V，样品加入量为20 μL(含OTC-BSA 5 μg)，用考马斯亮蓝染液染色6 h，乙酸脱色液脱色6 h，通过凝胶成像系统拍照，对比BSA与OTC-BSA电泳条带的位置差异判断偶联效果。

1.2.4 OTC多抗血清的制备与鉴定 选择4只6周龄的BALB/c小鼠，以30 μg/200 μL/只的剂量背部皮下多点注射免疫4次，每次间隔3周。首次免疫将OTC-BSA与等量FCA混合，后3次为加强免疫，将OTC-BSA与等量FIA混合。免疫完成后10 d断尾取血，获得OTC多抗血清。

(1) OTC多抗血清效价测定：采用间接ELISA法[16]。用CBS将OTC-OVA稀释并包被于96孔聚苯乙烯板，37 ℃孵育2 h，PBST洗板后加封闭液，37 ℃孵育1 h。向已包被抗原的聚苯乙烯板中加入倍比稀释的抗体，37 ℃孵育15 min，洗板后加入羊抗鼠酶标二抗，37 ℃孵育30 min，洗板后加入显色液，10 min后终止显色并读取OD450 nm值，当OD450 nm/空白孔OD450 nm≥2.1时，判定为阳性孔。

(2) OTC多抗血清敏感性鉴定：采用间接竞争ELISA法[17]。向已包被抗原的聚苯乙烯板中加入效价测定中OD450 nm值为1.0左右的血清稀释液和具有梯度浓度的OTC标品溶液，其他步骤同效价测定操作方法。通过计算抑制率，以B/B0为纵坐标(B为OTC不同浓度的OD450 nm值，B0为OTC零浓度的OD450 nm值)，OTC浓度对数值为横坐标绘制抑制曲线，得到线性回归方程，并以半数抑制浓度(IC50)来评定多抗血清敏感性。

1.2.5 OTC ELISA检测方法的建立

(1) 确定最佳包被浓度和工作浓度：将OTC-OVA分别稀释500，1 000，2 000，4 000，8 000倍进行包被，间接ELISA测定各包被浓度下抗体效价，选取效价测定中OD450 nm值1.0左右对应的稀释度作为多抗血清工作浓度，采用间接竞争ELISA测定各包被浓度下IC50，选择IC50最低一组所对应的包被浓度为最佳包被浓度，对应的多抗血清稀释度为最佳工作浓度。

(2) 建立标准曲线：配置不同浓度的OTC标品溶液，并根据已确定的最佳工作浓度，建立间接竞争ELISA方法。以B/B0为纵坐标，以OTC浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线。

(3) 检测限(LOD)：取不含OTC标品的空白样品，通过建立的间接竞争ELISA方法重复测定10次，计算10次OD450 nm值的平均值(X)以及标准差(SD)，然后计算X-2SD，将所得值代入标准曲线线性回归方程，计算出标准品浓度，即为检测限。

(4) 样品前处理：将新鲜牛奶样品，8 000 r/min离心10 min，除去上层脂肪，4 ℃保存备用。

(5) 回收率测定：将OTC标准品加入新鲜牛奶样品中，使其浓度分别为10，50，100 ng/mL，将加标样品进行前处理后，对每个浓度重复测定4次，根据所建立方法的标准曲线得到测定值，并计算其回收率。

(6) 特异性鉴定：选择CTC、TC、SARA、CA、BSA、OVA作为竞争物，利用所建立的间接竞争ELISA法测定各竞争物对多抗血清的IC50。以OTC的IC50与各竞争物的IC50的百分比作为交叉反应率，交叉反应率越低，则特异性越强[18]。

1.3 数据处理

对所得的数据利用Excel 2003进行处理(包括回归分析和显著性检验)，对分子结构式及合成路线图用ChemDraw Pro 18.0进行绘制。

2 结果与分析

2.1 OTC半抗原鉴定

OTC分子结构上含有一个酰胺基和一个活泼酚羟基。有研究[19]从酰胺基考虑，采用戊二醛法和碳二亚胺法使其与载体蛋白偶联，前期试验同样采用过此方法，但合成的人工抗原免疫效果差，不能满足后续试验需求。采用戊二醛法若不严格控制反应物加入顺序和反应时间，极易发生分子之间的自联，从而影响小分子抗原决定簇充分暴露，进而影响免疫效果[20]。因此试验从OTC分子上活泼的酚羟基考虑偶联，首先采用重氮化法合成OTC的半抗原，然后采用红外扫描(IR)法对OTC半抗原进行鉴定。图4、5分别为OTC和改造后OTC红外光谱图，改造后OTC除了含有OTC中原有化学基团外，在1 682.36 cm-1处出现羧基特征吸收峰，在2 360.46 cm-1处出现偶氮键特征吸收峰，证明OTC半抗原成功引入羧基基团。

2.2 OTC完全抗原鉴定

2.2.1 紫外扫描 OTC半抗原改造完成后，采用改进碳二亚胺法使其与载体蛋白偶联，合成完全抗原，首先利用紫外扫描(UV)法对完全抗原进行鉴定。OTC-BSA、BSA、OTC的紫外扫描图如图6所示，BSA在278 nm处出现特征吸收峰，而OTC-BSA的吸收光谱相比BSA发生了变化，特征吸收峰稍向左偏移，并未与BSA最大吸收峰重叠，初步说明OTC和BSA发生偶联。

图4 OTC红外光谱图

图5 改造后OTC红外光谱图

图6 OTC-BSA、BSA、OTC紫外扫描图

2.2.2 红外扫描 采用红外扫描法对完全抗原进行进一步鉴定，图7、8分别为BSA和OTC-BSA红外光谱图，合成的完全抗原OTC-BSA在1 652.51 cm-1处出现蛋白质中氨基酸的特征峰，在858.05，950.04，1 073.54，1 162.24，1 392.30 cm-1处，出现明显的OTC特征峰。结果进一步表明完全抗原偶联效果良好。

2.2.3 SDS-PAGE鉴定 图9为完全抗原OTC-BSA的SDS-PAGE鉴定结果，OTC-BSA电泳条带出现明显拖尾现象，其迁移速率小于BSA，说明OTC-BSA分子量大于BSA，也能够表明OTC和BSA偶联产生了较好的效果。

图7 BSA红外光谱图

图8 OTC-BSA红外光谱图

图9 OTC-BSA的SDS-PAGE鉴定结果

2.3 多抗血清鉴定

2.3.1 效价测定 表1为OTC多抗血清效价测定结果，4只免疫小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800，说明偶联的免疫原具有较好的免疫效果。

2.3.2 敏感性鉴定 表2为OTC多抗血清间接竞争ELISA测定结果，可以看出OTC对4只小鼠多抗血清均起到抑制作用，其中对2号小鼠血清抑制效果最好，其抑制曲线如图10所示，IC50为40.44 ng/mL，说明多抗血清敏感性良好。

表1 OTC多抗血清效价测定结果

表2 OTC多抗血清间接竞争ELISA测定结果

图10 2号小鼠多抗血清抑制曲线

2.4 OTC ELISA检测方法的建立

2.4.1 最佳包被浓度和工作浓度的确定 表3为OTC-OVA不同包被浓度下2号小鼠多抗血清效价结果，图11为OTC-OVA不同包被浓度下抗体的IC50，由表3测量结果选择不同包被浓度下抗体工作浓度分别为：1∶2 000，1∶2 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶100，并利用间接竞争ELISA测定OTC-OVA不同包被浓度下抗体的IC50，如图11所示当包被原为1∶1 000倍稀释，抗体为1∶2 000倍稀释时，其IC50最低，敏感性最好。

2.4.2 标准曲线的建立 根据已确定的最佳包被浓度和抗体工作浓度，建立间接竞争ELISA检测方法并绘制标准曲线，如图12所示。根据线性回归方程计算IC50为32.92 ng/mL。

2.4.3 检测限 通过建立的间接竞争ELISA方法测定空白样品，平行测定10次，OD450 nm分别为0.968，1.003，0.986，1.015，1.101，0.987，0.993，1.031，0.976，1.003，平均值(X)为1.006，标准差(SD)为0.038，计算X-2SD值(0.93)，再根据标准曲线求得LOD为1.3 ng/mL。

表3 不同包被浓度的效价测定结果

图11 不同包被浓度所对应的抗体IC50

图12 OTC间接竞争ELISA检测试剂盒标准曲线

2.4.4 回收率测定 间接竞争ELISA方法测定不同浓度OTC的牛奶样品结果如表4所示，回收率在84.70%～87.45%，变异系数在9.3%～11.5%，变异系数<15%，说明方法具有良好的准确度。

2.4.5 特异性鉴定 ELISA方法的特异性鉴定结果如表5所示，与CTC、TC的交叉反应率分别为5.27%，4.10%，与其他竞争物交叉反应率<0.4%，说明所建立的ELISA方法与CTC、TC存在微弱交叉反应，但与其他兽药及载体蛋白均无交叉反应，具有较强的特异性。

表4 回收率测定结果

表5 OTC多抗血清与竞争物的交叉反应

3 结论

试验采用重氮化法和碳二亚胺法成功合成OTC的完全抗原，所制备的小鼠多抗血清具有良好的敏感性，在此基础上初步建立OTC间接竞争ELISA检测方法，IC50为32.92 ng/mL，LOD为1.3 ng/mL，牛奶样品中添加回收率在84.70%～87.45%，与CTC、TC的交叉反应率分别为6.46%，5.01%，与其他竞争物交叉反应率<0.4%，具有良好的检测效果，可为监控OTC残留提供一定的技术支撑。