Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

赵 刚，闫 冰，刘鑫莹

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150000）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要侵害繁殖母猪和仔猪，引起母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道疾病和较高的死亡率。PRRS 的暴发蔓延，给世界各国养猪业造成巨大的经济损失，在中国每年有200 万头猪感染，近40 万头猪死亡。目前尚无针对该病的有效治疗药物，开发高效、安全、廉价的病毒疫苗是预防、控制PRRSV 感染的唯一可行办法。目前国内Marc-145 细胞制备猪繁殖与呼吸系统综合征病毒均采用转瓶生产工艺，由于受到转瓶表面积和培养条件的限制，生产细胞密度低，劳动强度大，操作过程易污染，疫苗质量难以得到保证。本研究采用细胞生物反应器技术生产PRRSV 抗原，并对培养过程中的各项技术条件进行优化，从而总结出一套较为合理的生产工艺，为PRRSV的大规模培养提供可靠的参考数据。

1 试验材料

1.1 细胞及病毒

Marc-145 细胞（购自中国兽医药品监察所），PRRSV HuN4-F112株（购自中国兽医药品监察所）。

1.2 主要试剂

MEM 培养基（购自GIBCO 公司）；新生牛血清（购自济南劲牛生物科技有限公司）；微载体Cytodex-1（购自德国GE 公司）；胰蛋白酶（购自美国Sigma 公司）；结晶紫细胞裂解液（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制）。

2 试验方法

2.1 Marc-145细胞复苏培养

将细胞冻存管自液氮罐中取出，置于37 ℃水浴，使管内冻存液迅速融化。常温1 000 r·min-1离心5 min。弃去上清，用少量细胞生长液将细胞重悬后移入细胞培养瓶中，加入10 mL 细胞生长液，于37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞长成单层后，用胰酶-EDTA 消化液消化，并按1:3进行扩增培养。

2.2 PRRSV在Marc-145细胞上的增值

Marc-145 细胞是PRRSV 的敏感细胞，病毒液不用激活。取已长成致密单层的细胞，弃掉其中的生长液，用不含血清的DMEM 洗细胞面3 次。吸净残余的维持液，加入PRRSV 病毒液0.2 mL，37 ℃吸附60 min，其间摇晃1 次·20 min-1，使病毒均匀、充分地吸附到细胞上。加入10 mL 的维持液，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞病变，当80%的细胞出现病变时收获病毒。将收获的病毒液于-20～37 ℃反复冻融3 次，保存于-80℃冰箱。

2.3 微载体预处理

称取所需质量的微载体Cytodex-1，按100 mL:1 g 的比例用PBS 浸泡微载体，轻微搅拌使微载体均匀浸泡3 h，121 ℃、灭菌30 min；倒掉PBS，以30 mL:1 g 的比例用培养基将微载体洗涤2 次，将微载体放置在4 ℃冰箱内平衡过夜，待用。

2.4 微载体细胞计数

取1 mL 含微载体的培养液，900 r·min-1离心5 min，后弃掉上清液，加入与上清液相同体积的0.1%结晶紫溶液，混匀后于37 ℃中孵育1 h，然后用血球计数板计数释放出来的细胞核，即为1 mL培养液中的细胞数。

2.5 病毒含量测定

将病毒液作连续10倍稀释，取1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-85 个稀释度，分别接种已长成良好单层Marc-145 细胞、弃去细胞培养液的96孔细胞板中，每个稀释度接种6 孔，100 μL·孔-1，同时设正常细胞对照，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 d，逐日观察细胞病变情况，并记录细胞病变的孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。

2.6 微载体培养PRRSV试验条件的优化

2.6.1 病毒维持液中血清浓度的确定

以4.0×105cells·mL-1的密度接种Marc-145 细胞，微载体Cytodex-1 的用量为4 g·L-1，待细胞培养72 h后，停止搅拌，静置使微载体沉淀，吸出上清液，用DMEM 洗涤3 次，按感染复数为0.1 的量加入PRRSV 病毒液，然后分别加入血清浓度为1%、2%、3%的病毒维持液，于不同时间取样测定病毒含量。确定病毒维持液中血清浓度。

2.6.2 病毒接毒时间的确定

以4×105cells·mL-1的密度接种细胞，微载体Cytodex-1 的用量为4 g·L-1，分别在细胞培养24、48 和72 h 后，停止搅拌，静置使微载体沉淀，吸出上清液，用DMEM 洗涤3 次，按感染复数为0.1的量加入PRRSV 病毒液，最后加入血清浓度为2%的病毒维持液，于不同时间取样测定病毒含量。确定最适的接毒时间。

2.6.3 感染复数（MOI）及最佳收获时间的确定

以4×105cells·mL-1的密度接种细胞，微载体Cytodex-1 的用量为4 g·L-1，细胞培养72 h 后，停止搅拌，静置后吸出上清液，用DMEM 洗涤3 次，分别按感染复数为0.20、0.05 和0.01 的量加入PRRSV，最后加入血清含量为2%的病毒维持液，于不同时间取样测定病毒含量。确定感染复数及最适收毒时间。

2.7 转瓶培养Marc145细胞增殖PRRSV

将Marc145 细胞扩大培养，增殖至10 L 转瓶中，培养72 h 后，细胞汇合度＞90%，按每个转瓶细胞数为2.6×108个·mL-1、MOI 为0.05 进行PRRSV接种培养。病毒接种后48 h收获，并进行病毒含量的测定。

3 结果与分析

3.1 PRRSV在Marc-145细胞上的增殖

PRRSV感染Marc-145细胞见图1。

由图1 可知，正常的Marc-145 细胞于传代后3 d 即可长成致密单层，透光性好、立体感强、界限清晰；接种PRRSV 后12 h，出现细胞病变，细胞界限模糊、透光性变差、细胞融合拉网、圆缩脱落。

图1 PRRSV感染Marc-145细胞

图2 维持液中血清浓度对病毒增殖的影响

3.2 病毒维持液中血清浓度的确定

当病毒维持液中血清浓度分别为1%、2%、3%时，于不同时间取样测定病毒含量结果见图2。

由图2 可知，用血清浓度为1%的病毒维持液培养时病毒滴度较低；维持液血清浓度为2%、3%，对病毒滴度影响不明显，病毒滴度均较高。综合考虑本试验维持液中血清浓度采用2%。

3.3 接毒时间的确定

分别在细胞培养24、48、72 h 后接毒，于不同时间取样测定病毒含量结果见图3。

图3 感染时间对病毒增殖的影响

由图3 可知，在细胞培养24 h 时细胞贴球率为40%，病毒滴度最低；在细胞生长最高峰72 h 时，细胞贴球率＞90%，接毒后病毒滴度最高为106.2TCID50·mL-1。由此可见PRRSV 增殖的效果与接毒时的细胞生长情况有关，接毒时细胞数量愈大，病毒滴度愈高，反之则较低。

3.4 感染复数（MOI）和收毒时间的确定

不同感染复数对PRRSV 增殖的影响结果见图4。

图4 感染复数对病毒增殖的影响

由图4 可知，过高或过低的感染复数（0.50 和0.01）均导致较低的病毒滴度，说明接毒剂量直接影响病毒的增殖效率。感染复数为0.05 时可获得最高的PRRSV 增殖效价，达到106.4TCID50·mL-1。此外各组试验结果均显示，接毒后48 h 的病毒效价均高于接毒后72 h的病毒效价，说明接毒后48 h可以作为收获病毒的最适时间。

3.5 不同培养系统中病毒含量的比较

试验结果可知，反应器生产病毒含量为106.6TCID50·mL-1、转瓶生产病毒含量为106.3TCID50·mL-1。表明用反应器生产病毒毒价比转瓶高。

4 讨论

病毒维持液中血清浓度的比较试验表明，使用维持液中血清含量1%不利于细胞的生长和繁殖，因此收获的病毒滴度也较低；血清含量2%、3%的对细胞生长最为有利，获得的毒价较高，但毒价差别不大。血清浓度也不能过高，血清浓度过高血清掩蔽了病毒与细胞的结合位点，导致病毒与细胞结合受阻，从而影响病毒的增殖。本试验选择最适的血清浓度为2%，因为此浓度下即保证细胞生长繁殖所需的营养，利于病毒毒价的提高，又可降低成本。

接毒时间过早，细胞处于生长早期，细胞数量较少，产生的病毒滴度也较少；如果接毒过晚，微载体上细胞数减少，细胞处于衰老阶段，同样影响病毒的增殖。在细胞生长到72 h时细胞数达到最大，接毒时产生的病毒含量最高。由此可见PRRSV增殖的效果与接毒时的细胞生长情况有关，接毒时细胞数量愈大，病毒滴度愈高，反之则较低。

感染复数（MOI）即单个细胞感染病毒的颗粒数，由此可确定接种病毒的剂量。MOI值可通过测定病毒感染性滴度和接种细胞的个数获得。本研究以不同MOI 感染Marc-145 细胞，分析其对病毒滴度的影响。本研究中0.05 的感染复数最为匹配PRRSV 感染及增殖过程的要求，试验结果表明，过高或过低的接毒量均不利于PRRSV 的增殖，其具体内在机理可能与Marc-145 细胞上PRRSV 的受体蛋白质表达丰度存在显著相关，有待深入研究。

试验研究了反应器、转瓶不同培养系统生产PRRSV。结果表明，用转瓶与反应器生产病毒毒价相近，病毒含量分别为106.7和106.3TCID50·mL-1。由于本文所研究的工艺是要适合于大规模工业生产，因此必须从操作的便利、成本以及最终效果来确定。