RRP15过表达对核糖体生物发生和细胞增殖的影响

印熙娣，陈 瑾，戈 靖，董智雄，4，朱长军，4

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；3.中国科学院生物化学与细胞生物学研究所 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，上海 200031；4.天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室，天津 300387）

核仁（Nucleolus）是真核细胞内无膜包被的亚细胞结构，是真核细胞核糖体生物发生的场所.核仁通过控制核糖体的生物发生和蛋白质合成调控细胞的生长、增殖、分化、代谢及应激等各项基本生命活动，核糖体生物发生的异常会引发贫血症、肿瘤等多种人类疾病[1-4].核糖体RNA 加工蛋白15（Ribosome RNA processing protein 15，RRP15）的 cDNA 序列全长有849 个核苷酸，编码283 个氨基酸，相对分子质量约为45×103.RRP15 蛋白在生物进化中高度保守，如在酵母中，RRP15p 参与核糖体60S 大亚基的生物发生[5]；在小鼠中，RRP15 可以调节细胞增殖和细胞凋亡，并在核糖体RNA 加工中发挥重要作用[6].有研究表明[7-8]，RRP15 集中定位于核仁，散布于细胞质.RRP15 除了参与pre-RNA剪切加工以外，还参与调控rDNA 转录，抑制RRP15表达可导致细胞内47S pre-rRNA 明显降低，干涉掉RRP15后核仁出现弥散现象，核仁结构遭到破坏.RRP15缺失会引起严重的核糖体压力（Ribosome stress），导致p53 功能正常的非转化二倍体细胞RPE1 的细胞周期阻滞在G1-G1/S 期，而p53 功能缺陷的肿瘤细胞HeLa和MCF7 阻滞在S-G2/M 期，最终走向凋亡[7-8].这些研究结果暗示RRP15 可能作为一个肿瘤治疗的靶标，应用于治疗p53 缺陷肿瘤.通过Oncomine 数据库分析发现，RRP15 在宫颈鳞癌中的表达量明显高于正常子宫颈组织中的表达量.

以往研究多针对RRP15 表达缺失对肿瘤发生的影响，RRP15 过表达对核糖体生物发生及细胞生长增殖等的影响还不清楚.为此，本研究构建RRP15 过表达的人宫颈癌细胞HeLa 稳筛细胞株及其对照细胞株，利用细胞免疫荧光、核糖体前体提取、MTT 以及蛋白免疫印迹等技术，研究RRP15 过表达对Hela 细胞的核仁结构、核糖体生物发生、细胞生长增殖等的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

人宫颈癌细胞株HeLa，购自美国模式菌种收集中心（ATCC）；pFlag、pFlag-RRP15 质粒为本实验室所有.

1.1.2 试剂

DMEM 培养基，美国Gibco 公司；胎牛血清，美国Hyclone 公司；Opti-MEM、Lipofectamine 3000、P3000、荧光标记或辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和DAPI，美国 Thermo Fisher Scientific 公司；特异性鼠抗α-Tubulin 单克隆抗体、特异性鼠抗Flag 单克隆抗体，美国Sigma 公司；特异性兔抗RRP15 多克隆抗体，由实验室自制；特异性鼠抗UBF 单克隆抗体，美国Santa Cruz 公司；特异性鼠抗Nucleolin 单克隆抗体，英国 Abcam 公司；新霉素（G418），德国 Calbiochem 公司；NP-40、 二甲基亚砜，北京索莱宝科技有限公司；MTT，上海碧云天生物技术有限公司.

1.1.3 仪器

蛋白电泳仪、 酶标仪，美国Bio-Rad 公司；Nikon TS-100 FL 倒置荧光显微镜，日本Nikon 公司；超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；5417R 高速离心机，德国 Eppendorf 公司；Optima L-80 XP 超速离心机，美国贝克曼公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific 公司.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代

用含有胎牛血清（体积分数为10%）的DMEM 培养基培养人宫颈癌细胞株HeLa，于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养.2～3 d 后观察细胞汇合度达到80%～90%，即可用含有EDTA（质量分数为0.02%）的胰酶消化处理进行传代培养.

1.2.2 细胞转染

在 24 孔板中，每孔加入 500 μL 的 DMEM 培养基，接种2×104个HeLa 细胞，混匀后置于细胞培养箱中培养24 h.按照说明书采用Lipofectamine 3000 转染试剂分别转染0.2 μg 的 pFlag-RRP15 或 pFlag 质粒.混匀后置于细胞培养箱中继续培养24 h.

1.2.3 G418 筛选

细胞转染24 h 后，用胰酶进行消化，收集细胞后转移到10 cm 的培养皿中，每皿中加入含G418（750 μg/mL）的 DMEM 培养基.培养 5 d 后，更换新鲜的含G418 的DMEM 培养基继续培养.10 d 后在倒置荧光显微镜下挑取细胞单克隆，置于24 孔板中培养，待细胞生长扩增后转移至10 cm 培养皿中继续扩增培养.

1.2.4 蛋白免疫印迹杂交（Western blot）

收集细胞，用1×Sample Buffer 裂解，所得裂解液进行SDS-PAGE 电泳，之后转移至PVDF 膜.用含有质量分数为5%的脱脂奶粉的TBS 缓冲液室温封闭30 min.随后室温一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加入ECL显色液，室温孵育2 min.暗室曝光，检测目的条带.

1.2.5 细胞免疫荧光（Immunofluorescence，IF）

向铺有细胞爬片的35 mm 平板中接种1.5×105个细胞，置于细胞培养箱中培养24 h.取出爬片，每板用1 mL 的PBS 洗3 次.之后后用3 mL 福尔马林固定液室温固定细胞15 min，弃去固定液，用PBS 洗3 次，再用含有0.1 mol/L 甘氨酸的PBS 终止固定反应.加入100 μL 封闭液室温封闭30 min，弃去封闭液.用含有Triton X-100（质量分数为 0.1%）的 PBST 洗 3 次.随后一抗室温孵育2 h，荧光标记的二抗室温避光孵育1 h，再用 1 μg/mL 的 DAPI 染色 3 min.封片，镜检.

1.2.6 核糖体前体提取

分别将3.7 mL 的质量分数为30%、20%和10%的蔗糖依次缓慢加入到超速离心管（14 mm×89 mm）内，使用 SW41 Ti 转子在 4 ℃、 230 000 r/min 下离心 3 h，建立提取核糖体前体所需的连续蔗糖密度梯度.用刮刀轻轻刮下 HeLa 细胞（3×106），收集到离心管中，4 ℃、500 r/min 下离心 5 min，用冰冷的 PBS 洗 3 次.用 2 mL低盐缓冲液（LSB）轻柔重悬细胞，冰上静置10 min，4 ℃、500 r/min 下离心 5 min.再用 2 mL LSB+（含蛋白酶抑制剂）重悬沉淀，补加66 μL 体积分数为10%的NP-40 和44 μL 体积分数为10%的脱氧胆酸钠，剧烈震荡 30 s，4 ℃、1 000 r/min 下离心 5 min.用 2 mL 的LSB+重悬沉淀，4 ℃、1 000 r/min 下离心 5 min.用500 μL 超声裂解缓冲液重悬沉淀，用15%的功率超声裂解细胞核，超声 1 s 停止 10 s，超声 3～5 次，4 ℃、15 000 r/min下离心15 min.将上清小心加入到已建立好的连续蔗糖密度梯度上，4 ℃、230 000 r/min 下离心3 h.

在离心后的离心管底部打适当大小的孔，将样品以等体积的量（600～700 μL）收集到 1.5 mL 离心管中.检测260 nm 处的吸光值A260确定RNA 含量，从而确定核糖体前体在每一管中的丰度大小.根据测量得到的每一管样品的A260绘制相对应的曲线图.

1.2.7 MTT 实验

在96 孔板中每孔接种3 000 个细胞，每种细胞5 个重复.待细胞贴壁完成后，每孔加入20 μL 体积分数为0.5%的MTT 溶液，37 ℃避光培养4 h 后终止培养，小心吸弃孔内的培养液.每孔加入100 μL 二甲基亚砜（DMSO），37 ℃孵育30 min，用酶标仪检测492 nm波长下每孔的吸光值.

2 结果与分析

2.1 HeLa-Flag RRP15过表达稳筛细胞株的构建

通过质粒转染和G418 筛选，收集挑选的阳性克隆细胞并进行裂解，利用Western blot 检测细胞内源和外源的RRP15 表达水平.在所挑选的18 个克隆中，有6 个克隆表达外源性Flag-RRP15 蛋白，其中，6#克隆表达的外源性Flag-RRP15 蛋白与内源性RRP15 水平相近，如图1（a）所示.经过灰度值测定得出，外源RRP15 的表达量是内源的1.13 倍；而对照细胞（HeLa-Flag）不表达外源性Flag-RRP15 蛋白.

为进一步确定筛选的稳定转染细胞中外源性Flag-RRP15 蛋白在细胞内的定位，利用纯化的兔抗RRP15 抗体和鼠抗Flag 抗体对细胞进行免疫荧光染色，结果如图1（b）所示.在低倍镜下，HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 细胞均可以被Flag 染色，表明所有细胞均表达了外源性蛋白；在高倍镜下，对照细胞HeLa-Flag 中Flag 染色均匀分散在整个细胞中，无特异性定位，而Flag-RRP15 过表达细胞株中Flag（外源性Flag-RRP15）与内源性RRP15 共定位，主要集中定位于核仁，少量散布于细胞质中，与本课题组的前期报道一致[8].由此证实，稳定过表达外源Flag-RRP15的细胞株构建成功.

图1 RRP15 过表达稳筛细胞株的鉴定Fig.1 Establishment of the RRP15-overexpressed stable cell lines

2.2 RRP15过表达对细胞核仁结构的影响

本课题组前期研究发现，干涉细胞内RRP15 的表达后，核仁结构被破坏，核仁定位的蛋白质出现弥散现象[8]，但是RRP15 过表达对核仁的影响并不明确.因此利用构建的HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 细胞株，分析RRP15 过表达对核仁产生的影响，结果如图2 所示.

图2 过表达RRP15 对核仁的影响Fig.2 Effect of RRP15 overexpression on nucleolus

HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 细胞分别固定后，利用鼠抗nucleolin 抗体分别对2 种细胞进行染色，结果如图2（a）所示.由图2（a）可以看出，RRP15 过表达后，Hela-Flag RRP15 细胞内核仁的数量明显增加.对HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 细胞的核仁数量进行统计，结果如图2（b）所示.由图2（b）可以看出，HeLa-Flag RRP15 细胞的核仁数量显著超过HeLa-Flag 细胞的核仁数量，与免疫荧光检测的结果一致.检测核仁相关蛋白的表达水平，结果如图2（c）所示，RRP15 过表达导致细胞内核仁相关蛋白（Nucleolin 和UBF）的表达水平显著升高.这些结果均表明，RRP15 的过表达可导致细胞内的核仁数量显著增加.

2.3 RRP15过表达对核糖体生物发生的影响

通过蔗糖密度梯度离心方法分别提取HeLa-Flag和HeLa-Flag RRP15 细胞中的核糖体大小亚基前体，分析RRP15 过表达对2 种细胞核糖体生物发生的影响，结果如图3 所示.由图3 可以看出，RRP15 过表达后，与 Hela-Flag 细胞相比，Hela-Flag RRP15 细胞的核糖体大亚基前体（pre-60S）和核糖体小亚基前体（pre-40S）的水平均明显提高，这一结果表明RRP15 过表达明显促进了细胞的核糖体生物发生.

图3 RRP15 过表达对核糖体生物发生的影响Fig.3 Effect of RRP15 overexpression on ribosome biogenesis

2.4 RRP15过表达对细胞生长增殖的影响

将同样数量的HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 细胞分别铺在96 孔板中，在不同时间内检测2 种细胞的增殖速率，结果如图4（a）所示.由图4（a）可以看出，与Hela-Flag 细胞相比，RRP15 过表达后，Hela-Flag RRP15 细胞的增殖速率明显提高，随着培养时间的延长，二者差距增大，120 h 时Hela-Flag RRP15 细胞的增殖量为对照细胞的1.6 倍.利用Western blot 进一步分析细胞周期相关蛋白的表达，结果如图4（b）所示.HeLa-Flag RRP15 中细胞周期蛋白cyclin D1 和cyclin B1 的表达水平明显高于HeLa-Flag 细胞的表达水平.由此证实，RRP15 过表达导致细胞增殖能力增强.

图4 RRP15 过表达对细胞生长增殖的影响Fig.4 Effect of RRP15 overexpression on cell proliferation

3 讨论与结论

核仁是真核细胞内核糖体生物发生的场所，核糖体负责细胞内蛋白质的合成.核糖体生物发生的异常与人类多种疾病尤其是肿瘤的发生发展密切相关，如髓增生异常综合症[9]、先天性再生障碍性贫血[10]、结肠癌等[11].有研究表明，RPL11、RPL5 以及 5S rRNA 可形成蛋白核酸复合体，抑制癌基因Mdm2 的E3 泛素连接酶活性，Mdm2 可作为E3 泛素连接酶泛素化抑癌基因p53，从而使细胞内的p53 蛋白表达维持在较低水平[12-15].这一代谢调节通路的异常会导致多种肿瘤的发生发展[11，16-17]：细胞受到外界刺激时会发生应激反应，产生核糖体压力，在核糖体压力条件下，RPL11 和RPL5 从核仁释放到细胞核基质中，与5S rRNA 以及Mdm2 形成复合体，抑制Mdm2 对p53 的泛素化，使细胞内p53 的蛋白水平升高（RP-Mdm2-p53 通路），从而激活细胞周期检验点，引起细胞周期的阻滞[18-19].RRP15的缺失也会引起严重的核糖体压力，影响p53 的正常表达[8].

为了解RRP15 过表达与肿瘤发生发展的关系，本课题组构建了稳定过表达RRP15 的HeLa 细胞株HeLa-Flag RRP15 及其对照细胞株HeLa-Flag。 研究发现RRP15 在子宫颈癌细胞中的过表达不仅可以使核仁数量增多，核仁蛋白的表达量上调，还可以使细胞的核糖体大小亚基前体的水平上调，细胞生长增殖速率加快，细胞周期相关蛋白的表达量增加.这些结果意味着RRP15 的过表达对肿瘤的发生发展具有潜在促进作用.在今后研究中，本课题组将进一步收集子宫颈癌的病例样本，详细分析RRP15 与子宫颈癌发病的关系，为最终明确RRP15 在肿瘤发生中的作用机制提供理论依据.