miR-132在卵泡刺激素介导的颗粒细胞孕酮合成中的作用

郑盼盼 姚 楠 高小博 骆海燕 邵馨妍 陆彩玲*

1.国家卫生健康委科学技术研究所(北京,100081);2.北京协和医学院研究生院

卵泡发育的机制复杂，涉及多种基因、激素、生长因子的相互作用[1]。卵泡刺激素(FSH)刺激颗粒细胞分化，是促卵泡发育成排卵前卵泡的主要信号[2]。颗粒细胞在FSH和黄体生成素(LH)的刺激下产生甾体激素雌激素和孕酮(P)，在月经周期以及卵泡发育、排卵和妊娠等起着关键的调节作用[3-4]。近10年来，对miRNA的研究揭示了miRNA在颗粒细胞增殖和甾体激素合成中扮演重要角色。miR-132是一个高度保守的miRNA。 Fiedler 等[5]发现miR-132是排卵前后小鼠颗粒细胞的差异表达基因之一，并受cAMP转录调控和诱导。笔者实验室前期以FSH刺激前后孕酮分泌显著增加的大鼠原代培养颗粒细胞为模型进行miRNA芯片分析，发现31个表达差异的miRNA，其中miR-132是筛选到的受FSH调控变化幅度差异最显著的基因之一[6]。miR-132在FSH介导的卵巢颗粒细胞合成孕酮中的作用未见报道。本研究以miR-132为研究对象，分析FSH对颗粒细胞miR-132表达的影响，探讨miR-132在孕酮合成中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

原代颗粒细胞，取自21d龄SD大鼠双侧卵巢组织。用含10%胎牛血清(FBS，美国Hyclone)的DMEM/F12培养基(美国Hyclone)在37℃、5% CO2的饱和湿度条件下培养。

1.2 原代颗粒细胞培养

健康21d龄的雌性SD大鼠购自于维通利华公司，每只大鼠腹腔注射20U孕马血清(PMSG，上海海德创业生物公司)，并给予饮水、饲料和自动控制温度光照饲养。48h后颈椎脱臼处死，无菌条件下剖腹取出卵巢，用注射器针头刺破卵泡释放颗粒细胞。将颗粒细胞重悬并以合适的密度接种于细胞培养皿中，置于CO2培养箱培养，以备后续处理。

1.3 腺病毒感染及FSH处理

重组腺病毒Ad-miR对照和Ad-miR132购自上海吉凯科技有限公司。每个35mm培养皿以3×1011粒子/ml的腺病毒感染颗粒细胞，培养5h后换成无血清培养基培养，24 h后用50ng/ml FSH暴露处理原代颗粒细胞24 h。

1.4 颗粒细胞RNA提取及实时定量RT-PCR检测

取经培养及不同处理的原代颗粒细胞，弃培养液，加入1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加入RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen)，充分吹打至细胞完全溶解后，利用苯酚/氯仿抽提法提取RNA。取1μg RNA，利用RNA反转录试剂盒(美国Thermo)和梯度PCR仪(英国Techne)将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用实时定量PCR仪(美国ABI Prism 7500)检测细胞miR-132的水平，以U6snRNA的表达水平为内参，实时定量RT-PCR引物U6snRNA由华大基因公司合成。

1.5 放射免疫法测定P

原代颗粒细胞用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养，经过不同处理后收集细胞上清，储存于-20℃，采用放射免疫法测定P水平。

1.6 Western Blot检测Foxo3a的表达

用50ng/ml的FSH分别处理原代颗粒细胞0，6，12，24和48h后，收集原代颗粒细胞，加入20μl 高效细胞裂解液(RIPA，北京索莱宝科技有限公司)冰上漩涡震荡裂解30min，12 000rpm 4℃离心15min，收集上清。利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(美国Thermo)进行蛋白浓度定量，全自动酶标仪(德国BioTek)进行数据检测。12% SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭后，Anti-Foxo3a(兔多克隆抗体，美国CST，1:1000)和β-actin抗体(小鼠单克隆抗体，美国Sigma，1:2000)分别于4℃孵育过夜。TBST漂洗，随后用HRP标记的二抗1:2000[辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司]室温孵育1 h，TBST漂洗，ECL化学发光液(美国Merck Millipore)显影，其中β-actin为内参。用Image J软件定量分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学处理

采用 GraphPad Prism 5.0软件进行分析，计量数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FSH对原代颗粒细胞miR-132表达的影响

原代颗粒细胞经50ng/ml FSH暴露后miR-132的表达量升高，在48h时表达量最高(图1)。

图1 FSH暴露不同时间miR-132相对浓度的表达

2.2 重组腺病毒过表达miR-132的鉴定

感染Ad-miR132组的细胞miR-132表达水平高于腺病毒Ad-miR对照组(P<0.001)(图2)。

2.3 miR-132过表达对颗粒细胞孕酮合成的影响

FSH暴露处理24h后,感染Ad-miR132组P水平高于空白对照组和Ad-miR对照组(P<0.001)(图3)。

***与重组腺病毒Ad-miR对照组比较P<0.001图2 重组腺病毒感染后miR-132相对浓度的表达

***与未经FSH处理组比较P<0.001###与重组腺病毒Ad-miR对照组比较P<0.001图3 miR-132过表达后P合成水平

2.4 FSH对颗粒细胞Foxo3a表达的影响

在FSH处理后的不同时间点，Foxo3a表达呈现逐渐下降的趋势(图4)，提示miR-132可能负调控了Foxo3a的表达。

与未经FSH处理组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***P <0.001A：蛋白免疫印迹 B：柱状图图4 FSH暴露不同时间Foxo3a的相对表达

3 讨论

颗粒细胞表面有丰富的FSH受体(FSHR)，FSH与FSHR结合后引起胞内cAMP水平增加，进而激活蛋白激酶A(PKA)，PKA通过直接磷酸化或间接激活其他多个信号通路调控，包括cAMP响应原件结合蛋白(CREB)、甾体激素合成急性调节蛋白(StAR)、骨形成蛋白(BMPs)等多个蛋白，促进颗粒细胞增殖和甾体激素的合成[6-7]。

近来发现FSH与颗粒细胞中miRNA表达调控和功能密切相关。本课题组早期研究发现一系列miRNA在卵泡发育中呈现差异表达，并受到FSH调控[8]。Fiedler 等[5]利用实时定量RT-PCR研究发现FSH介导的小鼠排卵前和排卵期卵泡颗粒细胞miR-21的表达升高。Yin等[9]证明FSH能够抑制ICR雌性大鼠颗粒细胞中miR-320的表达，而miR-320过表达部分抑制了FSH诱导的颗粒细胞增殖。Sirotkin 等[10]首次探讨miRNA对颗粒细胞增殖及甾体激素合成影响。本文根据FSH刺激前后原代颗粒细胞miRNA芯片的结果，分析了原代颗粒细胞用FSH处理后miR-132的表达情况，发现FSH刺激miR-132表达升高，与芯片筛查结果一致。文献报道，在cAMP处理的大鼠颗粒细胞和促肾上腺皮质激素(ACTH)暴露的肾上腺中观察到miR-132的表达上调[11]，在LH介导的排卵期小鼠的壁状颗粒细胞中miR-132的表达上调[5]。Hu等[12]证明miR-132在原代大鼠卵巢颗粒细胞通过cAMP/PKA信号通路上调，并直接作用于靶基因StAR，在甾体激素生物合成的转录后调控中发挥关键作用。提示FSH可能通过cAMP/PKA通路上调miR-132的表达。本研究发现miR-132过表达促进FSH介导的卵巢颗粒细胞孕酮的合成，进一步验证了miRNA对颗粒细胞孕酮合成的调控。

叉头基因转录因子家族(Foxo)是参与调节细胞周期、自噬、能量代谢等细胞功能的一类重要的超级蛋白家族，Foxo3a是该家族研究最受关注的成员，Foxo3a在卵泡发育中发挥重要作用[13]。Liu等[14]证明干细胞因子(SCF)可以通过Foxo3a的磷酸化(失活)阻止大鼠卵母细胞的凋亡，提示Foxo3a参与调控卵巢卵母细胞的凋亡和原始卵泡的形成。孟春花等[15]发现Foxo3a基因可抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。也有学者发现过表达Foxo3a可通过降低BMP-15和Smad蛋白抑制小鼠颗粒细胞增殖[16]，以及在体外培养环境中Foxo3a基因上调细胞Bim等凋亡相关蛋白活性导致大鼠卵巢颗粒细胞以细胞凋亡为主[17]。Ahmet 等[18]报道miR-212/132通过靶向负调控Foxo3a抑制心肌肥厚。Wong等[19]证明miR-132的两个关键靶蛋白PTEN和Foxo3a均与蛋白激酶B(AKT)信号通路相关，且在原代神经元中miR-132缺失时上调。Kim等[20]研究炎症性肠病患者的模型证明miR-132和miR-223通过负性调控Foxo3a增强炎症细胞因子的表达。本研究结果显示，在FSH处理颗粒细胞不同时间点，Foxo3a表达呈现逐渐下降的趋势，与miR-132的表达模式呈现反相关，提示在FSH介导的颗粒细胞甾体激素合成中miR-132可能负调控了Foxo3a的表达。

综上，本研究表明miR-132能够促进卵泡刺激素介导的卵巢颗粒细胞P的合成，其机制可能与负调卵泡发育相关基因Foxo3a表达相关。笔者在上述研究的基础上，将探索miR-132调控甾体激素的分子机制以及与FSH调控甾体激素合成的其他已鉴定的通路的关系，进一步揭示miR-132在卵巢颗粒细胞甾体激素合成中的分子机制。