棘白霉素B母核在低级醇-丙酮体系中的纯化研究

王晶珂，谢新宇，张炜，王崔岩，冷凤，李敏*

( 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心微生物药物国家工程研究中心，石家庄 050015)

阿尼芬净(Anidulafungin)是一种新型抗真菌抗生素，它是第三代棘白菌素类半合成抗真菌药，该类药物可靶向作用于真菌细胞壁，通过抑制β-葡聚糖的合成来杀灭真菌[1]，具有杀菌活性强、毒性低、不良反应少等特点[2]，是一种治疗真菌感染非常有效的药物，尤其是在治疗顽固深部真菌感染方面有很好的效果[3]。阿尼芬净具有强大的体内和体外抗菌活性，与其他棘白菌素类抗真菌药相比，阿尼芬净具有更大的分布容积和更广谱的抗菌活性[4]，其合成前体(Echinocandin B Nucleus,ECBN)是棘白霉素B(Echinocandin B，ECB)在犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)代谢产生的脱酰酶作用下，脱去不饱和脂肪侧链得到的产物[5]，结构式见图1。

ECBN的结晶是阿尼芬净母核制备过程中最为关键的一个步骤，其结晶质量直接决定了后续纳米微球纯化步骤的难易程度，对终产品阿尼芬净质量也会有很大影响。ECBN结晶条件复杂，可选溶剂多，本文探讨了ECBN浓缩液在低级醇-丙酮体系中结晶对纯化效果的影响，摸索出了最佳纯化条件。

图1 棘白霉素B母核结构式

1 实验

1.1 实验原料、试剂及设备

岛津LC-2010A HT型高效液相色谱仪；真空干燥箱。

磷酸氢二甲；乙醇；丙酮；冰醋酸均为分析纯；乙腈(色谱纯)，美国Merck公司，三氟乙酸(色谱纯)，美国Merck公司；去离子水，自制；ECBN浓缩液(10万单位)，自制，通过发酵液预提取得到；棘白霉素B母核标准品，自制，批号：S201808，含量89.6%。

2 方法

2.1 棘白霉素B母核浓缩液制备方法

棘白霉素B母核浓缩液是其发酵液经过滤、吸附解吸、浓缩等步骤预提取得到，制备的浓缩液的色谱纯度为87.68%，含量64.24%，浓缩液为10W单位。

2.2 色谱方法

1色谱纯度方法：色谱柱：H y p e r s i l C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相 水：乙腈：三氟乙酸=96:4:0.02；流速1.0ml/min；进样量：5μL；柱温40℃；检测波长210nm；运行时间：30min，进样浓度：200-500μg/mL。

2含量测定方法：通过与标准品对照，根据色谱方法峰面积计算得到。

2.3 实验方法

将乙醇和丙酮按照特定的比例混合均匀，下文将其称之为混合液，将ECBN浓缩液(10W单位)用蠕动泵匀速滴加到盛有混合液的结晶器中，滴加完毕后继续搅拌2h，在1～5℃下放置12h，抽滤，在45℃真空烤干得到干粉，液相检测其色谱纯度，并计算含量。

3 结果与讨论

3.1 选择混合液

ECBN易溶于水，微溶于低级醇类，不溶于丙酮，ECBN在纯丙酮中结晶纯化效果差，结晶液在纯丙酮中分散困难，甚至有结块现象出现，因此考虑用低级醇/丙酮混合液结晶，优化结晶过程和效果。

混合液的成分对纯化效果有很大影响，分别采用甲醇/丙酮、乙醇/丙酮、异丙醇/丙酮作为混合液，将浓缩液匀速加入混合液中，考察不同醇类对纯化效果的影响，本实验中混合液中醇类加量均为5%，混合液含量为浓缩液的10倍体积，按照2.2所述实验方法进行结晶实验。实验结果见表1：

由表中实验数据可以看出，ECBN在低级醇-丙酮体系中结晶有很明显的纯化效果，其中在乙醇/丙酮和甲醇/丙酮体系中，所得干粉的色谱纯度和含量均有大幅度的提高，异丙醇/丙酮混合液纯化效果较差，所选三种醇类/丙酮混合液对收率的影响并不明显，甲醇/丙酮体系收率略低，乙醇/丙酮混合液纯化效果最好，为最佳纯化体系，以下实验都是在此体系下完成。

3.2 混合液中乙醇含量对纯化效果和收率的影响

乙醇/丙酮体系中乙醇含量是纯化效果和收率的关键影响因素，逐渐增加混合液中乙醇含量，乙醇含量从1%～7%逐次增加，研究其对纯化效果的影响，用液相检测其色谱纯度和含量，并计算纯化收率，本次实验混合液用量为浓缩液体积的10倍体积。

表1 混合液成分对纯化效果的影响

图2 混合液中乙醇含量对色谱纯度的影响

图3 混合液中乙醇含量对含量的影响

随着混合液中乙醇含量的增加，结晶后的ECBN色谱纯度迅速增加，上升趋势明显，所选ECBN浓缩液在纯丙酮中结晶得到的干粉色谱纯度仅为88.76%，当混合液中乙醇含量为5%时，纯化效果已极为明显，色谱纯度高达93.68%，当乙醇含量增加至7%时，色谱纯度可达94.05%。

与色谱纯度类似，随着混合液中乙醇含量的增加，见图3，结晶后的ECBN含量迅速增加，所选ECBN浓缩液在纯丙酮中结晶得到的干粉含量仅为66.30%，当混合液中乙醇含量为5%时，含量大幅提高至76.88%，当乙醇含量增加至7%时，含量可达77.46%。

根据干粉含量计算结晶步骤的收率，从而确定乙醇在混合液中较优的含量，图4为混合液中乙醇含量收率的影响，图中可以看到随着混合液中乙醇含量的增加，结晶收率不断下降，这是因为随着混合液中乙醇含量的不断增加，ECBN在体系中溶解度也会逐渐提高。当混合液中乙醇含量大于6%时，收率下降较为明显，当乙醇含量大于7%时，收率仅为88.1%，考虑到混合液中乙醇含量大于时5%，所得干粉含量和色谱纯度增加幅度较小，可认为混合液中乙醇含量5%～6%为最佳纯化含量，此时所得干粉的纯化效果极好，收率较高。

3.3 混合液用量对纯化效果的影响

本步骤考察了混合液用量对色谱纯度的影响，实验中用浓缩液体积作为基准，混合液用量用浓缩液体积倍数计量，混合液用量在浓缩液体积的2～14倍范围内进行选择，用液相考察纯化效果和收率，本次实验中混合液为乙醇/丙酮体系，乙醇含量为5%。

图4 混合液中乙醇含量对收率的影响

本实验中发现混合液用量的增加只是略微降低了所得ECBN干粉的的色谱纯度，对纯化效果的影响并不太明显，见图5，当混合液的用量为浓缩液的2倍体积时，所得干粉的色谱纯度为94.89%，当混合液用量为浓缩液体积的14倍体积时，干粉色谱纯度93.22%，色谱纯度下降幅度并不大。

如图6所示，随着混液用量的增加，纯化收率迅速升高，当混合液用量为浓缩液8倍体积时，纯化收率就可达91.6%，综合考虑混合液用量对色谱纯度的影响有限，可以确定混合液的最佳用量为浓缩液的10～12倍体积。

图5 混合液用量对色谱纯度的影响

图6 混合液用量对收率的影响

图7 棘白霉素B母核液相图

4 小结

本实验制备制出ECBN无定形干粉，与晶体相比无定形状态的表面自由能更高，在水中溶解速率更高[6,7]，有利于之后相关纯化步骤的进行。

本实验确定了ECBN最佳的结晶条件，在乙醇/丙酮体系中对棘白霉素B母核进行结晶纯化，可制备出较高纯度的ECBN不定形干粉，在此体系中，当乙醇含量为5%混合液用量为10BV时，可以纯化出色谱纯度高达93.68%，含量高达76.88%干粉(图7)，本方法对ECBN的纯化效果极为明显，并且有较高的收率，可达90%以上。