亲水作用色谱-串联质谱法测定动物源食品中10种氨基糖苷类药物的残留量

宓捷波，张敏，柴铭骏，刘旸，常春艳

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461）

氨基糖苷类药物是由链霉菌或小单胞菌培养液中提取，或合成的一类水溶性碱性抗生素，可作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质的合成，并破坏细菌细胞膜的完整性，对需氧革兰氏阴性菌、单胞菌属、葡萄球菌属及结核杆菌均有抗菌活性[1-3]。氨基糖苷类药物核心的分子结构为一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子通过配糖键相连接，典型的代表药物有链霉素、双氢链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素等。在农业、畜牧业和水产业中，氨基糖苷类药物可以有效抑制细菌的生长和繁殖，因此常被作为兽药治疗家畜肠炎、赤皮病、白头白嘴病等。由于对药物的不合理使用及违法使用等情况，导致的氨基糖苷类抗生素在食品中残留问题，已经引起国内外的普遍关注。如美国、加拿大等国相关机构调查发现链霉素是仅次于青霉素的最常在动物中残留超标的药物；国内也曾在猪肾猪肝中检出严重超标的链霉素。医学的进一步研究也发现，氨基糖苷类药物虽然具有强大的杀菌作用，但会导致人体内蛋白质合成异常，从而引发口周和手足麻木、神经性的肌肉阻滞，蛋白尿、肾小球滤过减少、氮质血症等肾脏疾病。因此，有必要对动物源食品中的氨基糖苷类药物残留进行检测。

氨基糖苷类药物的检测本身并不困难，如微生物法[4]、酶联免疫法[5-8]、液相色谱法[9-12]、气相色谱法[13]、液相色谱-串联质谱法[14-19]等都曾用于食品、生物体液及环境中氨基糖苷类药物的检测。对于食品中氨基糖苷类药物的残留分析而言，液相色谱-串联质谱法以其特有的定性定量准确的特征成为近年来食品行业中的重要方法。由于氨基糖苷类药物极性大，在常规反相色谱柱上保留性能不佳，往往采用在流动相中加入烷基磺酸钠或七氟丁酸等离子对试剂改善保留性能。然而，离子对试剂对质谱性能会造成不可逆转的影响[20]，导致质谱对负离子的分析性能降低，即分析氨基糖苷类药物用的质谱将只能用于正离子测定，这也是目前该类药物分析面临的最大困难。因此，不采用离子对试剂作为流动相组分的亲水作用色谱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）逐渐成为氨基糖苷类等极性物质分析研究的热点。本研究通过对不同键合相的亲水作用色谱条件进行优化，建立动物源性食品中10 种氨基糖苷类药物残留量的检测方法，克服常规方法损伤质谱的缺陷，提高方法的实用性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 材料与试剂

试验用的猪肉、牛肉、猪肾和牛肝均为天津口岸进出口的日常检测样品。

乙腈、甲酸（色谱纯）：德国Merck 公司；三氯乙酸、七氟丁酸、庚烷磺酸钠（分析纯）：Sigma-Aldrich 公司（美国）；乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetate dehydrate，EDTA-2Na）、磷酸、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾（分析纯）：天津试剂公司；丁胺卡那霉素、潮霉素B、奇霉素、链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、新霉素、安普霉素、妥布霉素和庆大霉素（纯度大于99%）：Dr.E hretorfer GmbH 公司。试验用水为去离子水。

1.1.2 仪器与设备

Agilent 1200-API 4000 液相色谱-串联质谱仪：AB Sciex 公司；Sielc Obelisc R 色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）：飞诺美公司；ACQUITY UPLC BEH HILIC 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：沃特世公司；GL Sciences InertSustain Amide 色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）：岛津（上海）试验器材有限公司；TSKgel Amide-80 色谱柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）：东曹（上海）生物科技有限公司；IKA HS501 水平往复振荡仪、IKA MS3 basic 涡旋混合器：艾卡（广州）仪器设备有限公司；Avanti J-30I高速冷冻离心机：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；SPE-24 固相萃取装置：博纳艾杰尔科技有限公司；NEVAP-34 氮气浓缩仪：organomation 公司。

1.2 样品预处理

称取试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入10 mL 含0.4 mmol/L EDTA、2%三氯乙酸的磷酸缓冲液（pH 4.0），振荡提取10 min，离心取上清，对残渣重复提取1 次，合并两次提取的上清液，用1 mol/L盐酸调pH 值为3.5，加入2 mL 100 mmol/L 七氟丁酸溶液，涡旋混匀后在预先经3 mL 甲醇、3 mL 去离子水活化的C18 固相萃取柱上样，然后先用3 mL 20 mmol/L七氟丁酸溶液洗涤，再用水洗涤2 次，每次3 mL，抽干，最后用5 mL 乙腈-20 mmol/L 七氟丁酸溶液（体积比 8 ∶2）洗脱，洗脱液于40 ℃氮吹至小于1 mL，用含4 %甲酸的0.01 mol/L 庚烷磺酸钠溶液定容至1 mL，过膜，待测。

1.3 色谱质谱条件

色谱条件：Sielc Obelisc R 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），流速 0.3 mL/min，进样量 20 μL，流动相 A 为1%的甲酸水，流动相B 为乙腈，流动相C 为水，采用梯度进行洗脱分离。

梯度洗脱程序如表1 所示。

质谱条件：采用正离子扫描模式，喷雾电压为5 500 V，雾化气压力为12 psi（1 psi=0.006 89 MPa），气帘气压力为20 psi，辅助气1 压力为55 psi，辅助气2压力为50 psi，离子源温度为600 ℃，采用多反应监测模式。

10 种氨基糖苷类药物的定性定量离子对等信息见表2。

表2 10 种氨基糖苷类药物的质谱分析参数Table 2 MS paramaters for 10 aminoglycosides

续表2 10 种氨基糖苷类药物的质谱分析参数Continue table 2 MS paramaters for 10 aminoglycosides

2 结果与分析

2.1 亲水作用色谱柱的选择

一般认为，亲水作用色谱的保留机制主要包括键合固定相水层和流动相之间的分配作用、氢键或偶极之间的吸附作用以及静电作用[21-22]。亲水作用色谱的键合固定相种类繁多，包括未衍生的硅胶以及氨基、酰胺基、氰基修饰的硅胶等[23]。不同的键合固定相在分离目标物的过程中往往保留机制迥异，需要通过具体的试验进行选择。本试验主要对ACQUITY UPLC BEH HILIC 柱（键合相为硅胶）、GL Sciences InertSustain Amide（键合相为酰胺基）柱、TSKgel Amide-80（键合相为酰胺基）柱和Sielc Obelisc R（键合相为含电荷的极性和非极性混合基团）色谱柱分离氨基糖苷类药物的效果进行了比较。

潮霉素B、安普霉素和新霉素在3 种色谱柱上的分离色谱图见图1。

试验结果显示，BEH HILIC 柱分离氨基糖苷类药物效果不佳，其余3 种色谱柱可以对目标物实现分离。其中InertSustain Amide 柱在流动相含100 mmol/L 甲酸铵的条件下以乙腈和水可以实现氨基糖胺类物质的分离，但潮霉素B、奇霉素会出现双峰，目标物响应强度相应较弱。而TSK gelAmide-80 柱和Sielc Obelisc R 键合相的亲水作用色谱柱对目标物的分离较为相似，采用1%甲酸水和乙腈为流动相的条件下可以实现氨基糖苷类药物的分离。TSKgel Amide-80 柱上目标物质虽为单一峰形，但峰形有展宽，且拖尾，而含有阳离子极性与非极性混合作用机理模式的Sielc O－belisc R 色谱柱上各物质的分离效果最好。故最终采用Sielc Obelisc R 色谱柱。

图1 潮霉素B、安普霉素和新霉素在3 种色谱柱上的分离图Fig.1 Separation of hygromycin B，apramycin and neomycin in different column

2.2 流动相pH值的优化

氨基糖苷类药物包含多个氨基结构，属于碱性糖苷，因此在与Sielc Obelisc R 柱填料相互作用的过程中，流动相的pH 值会显著影响氨基糖苷类物质的电荷状态，进而影响其在色谱柱上受到的静电作用的大小，导致分离性能出现差异[24]。本研究分别比较了0.1%甲酸水，0.5 %甲酸水和1 %甲酸水对于目标物分离的影响。

妥布霉素在不同甲酸含量流动相中的分离情况见图2。

由图2 可知，1%甲酸水作为流动相的效果最佳。这是由于流动相的pH 值越低，碱性的氨基糖苷类药物Sielc Obelisc R 柱填料表面均带正电荷，存在排斥作用，避免了因静电吸引而导致的峰形拖尾，同时保留时间也明显缩短。试验中，InertSustain Amide 柱和TSKgel Amide-80 柱在1%甲酸水的条件下拖尾现象也有所改善，但峰整体展宽很严重，说明酰胺基的键合相对目标物的吸附作用更强，不易洗脱。

2.3 HILIC色谱柱分析稳定条件的探索

图2 流动相pH 值对亲水作用色谱分离氨基糖苷类药物的影响Fig.2 The effect of pH value of mobile phase during the separation of aminoglycosides using HILIC column

一些文献[21-25]显示，HILIC 机制的色谱柱在使用过程中往往存在保留时间不稳定的情况，本研究也对氨基糖苷类药物在HILIC 柱上分析的稳定性进行了研究。结果显示，HILIC 柱需要比常规反相色谱柱更长的平衡时间，一旦流动相条件发生变化，至少需要进行30 min 以上的重新平衡时间。而且梯度洗脱程序中的平衡时间也相对较长，本方法在目标物洗脱完成后10 min 才使柱压恢复到起始压力。此外，HILIC 柱需保持高比例的有机相，因此每次试验后需及时将色谱柱从仪器上取下，否则易出现HILIC 柱中有机相挥发导致的柱压上升并进而影响分离的情况。鉴于上述原因，本方法的梯度洗脱程序后期采用了近11 min 的平衡时间，且保证每次使用后及时将色谱柱两端封口。在这种条件下，HILIC 柱对氨基糖苷类药物的分离效果十分稳定。

2.4 净化柱和定容溶液的优化

尽管HILIC 填料固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱或定制柱也可用于氨基糖苷类药物的净化，但商品化产品相对较少，定制价格较高，且洗脱条件随目标物的类别变化而变化，通用性较差，目前国内外应用相对较少。鉴于氨基糖苷类药物强极性和碱性的特征，离子交换柱和C18 柱（配合离子对试剂）SPE 是文献中应用较多的两种固相萃取柱。本研究中分别用弱阳离子交换柱（weak cation exchange，WCX）和C18 SPE 柱对猪肉组织中10 种氨基糖苷类药物进行净化，结果显示链霉素、双氢链霉素和卡那霉素用WCX 柱净化时效果较好，但其他7 种物质的净化效果不理想，而C18 SPE 柱在七氟丁酸离子对和酸性缓冲液的作用下对10 种氨基糖苷类药物均能实现较好的净化效果。这可能与氨基糖苷类药物本身带电荷状态受pH 值影响有关，离子交换作用可能导致部分物质与填料发生较强的作用而不易洗脱，而离子对试剂存在下，目标物在C18 SPE 柱上仅受极性作用，相对洗脱较为顺利。因此，本研究最终采用C18 SPE 柱配合七氟丁酸溶液进行净化处理。

对于定容溶液的选择，试验中比较了七氟丁酸和庚烷磺酸钠溶液，结果显示庚烷磺酸钠定容后氨基糖苷类药物的色谱分离效果更好。

2.5 方法的标准曲线和定量限

混合标准工作曲线采用空白猪肉基质提取液稀释混合标准储备溶液的方式配制，再以亲水作用色谱串联质谱检测，计算拟合标准曲线。试验结果显示，以测定结果的峰面积（y）为纵坐标，分析物的浓度（x）为横坐标，10 种氨基糖苷类药物在50 ng/mL～5 000 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.99。同时，通过在空白样品中进行加标测定，以提取离子色谱峰的信噪比（S/N）大于10 计算方法的定量限[26]：新霉素、潮霉素B 和安普霉素为100 μg/kg，奇霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素为20 μg/kg，可以满足目前国内外对氨基糖苷类药物的最大残留限量的要求。

10 种氨基糖苷类物质的提取离子色谱图见图3。

由图3 可以看出，10 种氨基糖苷类药物可在本研究条件下获得很好的分离，并且峰形尖锐。

图3 10 种氨基糖苷类药物经亲水作用色谱柱分离的提取离子色谱图Fig.3 MRM chromatograms of ten aminoglycosides separated by HILIC column

2.6 回收率和精密度

在空白的猪肉、牛肉、猪肾和牛肝样品中添加20、40、200 μg/kg 的丁胺卡那霉素、奇霉素、链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素和100、200、1 000 μg/kg 的新霉素、潮霉素B 和安普霉素，以各自的定量离子对进行定量。

猪肉、牛肉、猪肾和牛肝中10 种氨基糖苷类药物的添加回收率和精密度的结果见表3。

表3 的结果显示，在猪肉、牛肉、猪肾和牛肝中分别添加1 倍、2 倍和10 倍定量限的10 种氨基糖苷类药物的检测回收率为73.9%～103.6%，相对标准偏差为3.3%～14.8%，可以满足分析检测的需要。

表3 不同基质中10 种氨基糖苷类药物的添加回收和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of ten aminoglycosides spiked in different matrices（n=6）

3 结论

本研究针对质谱分析氨基糖苷类药物时的常规反相色谱无法有效分析目标物的缺陷，通过4 种HILIC 机理色谱柱的比较和流动相及净化定容溶液的优化，建立了动物源食品中10 种氨基糖苷类药物残留量检测的亲水作用色谱-串联质谱方法。虽然亲水作用色谱体系中的相互作用机制较为复杂，需要针对目标物进行流动相和预处理方法的反复调整，但与常规的反相色谱体系相比，本方法避免在流动相中使用大量离子对试剂，利于质谱检测。本方法的灵敏度高，重现性好，适于推广。