液质联用法检测降血糖类保健食品中非法添加的13种化学药物

覃娟，谢柏艳，杨玉平，王琳，雷霁远，彭树翔，涂林

（武汉药品医疗器械检验所，湖北武汉430075）

随着生活节奏不断加快，处于亚健康状态的人群不断增多，使用保健食品改善和调节人体功能也成为人们自我保健的趋势，与日俱增的糖尿病患者对辅助降糖的保健食品需求量越来越大，但在降糖类保健食品中的非法添加降糖类化学药物成分的现象却时有发生，此举对消费者造成了极大的隐患和危害，轻则引起毒性反应，严重甚至危及生命[1-5]。为保证消费者的权益，国家食品药品监督管理总局先后颁布了3 个药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号为 2009029、2011008、2013001），共 4 个液相系统，用于辅助降血糖类中成药及保健食品中13 种降糖类化学药品的非法添加检测。经液相检出的阳性样品需通过一级、二级质谱全扫描确证，但3 个批准件中的高效液相色谱-质谱联用法中未注明各待测物质的详细质谱条件，不便操作且效率较低[6-8]。有些降糖类保健食品采用药物复合添加的方式，使部分降糖类化学药物的添加浓度处于较低浓度水平[9]。含量低于液相系统检出限的样品不能被检出，按批准件要求不再进行质谱确证，可能出现假阴性现象；某些极性物质色谱保留时间较小，由于复杂基质的影响，有时还是有假阳性现象产生[10]。LC-MS/MS 能够区分或消除复杂基质中的其他物质的干扰，灵敏度高，分析速度快，可保证定性、定量检测的可靠性，降低假阳性率和假阴性率[11-13]。

本文旨在研究建立一种操作简便、快速可靠、灵敏度高LC-MS/MS 检测方法，同时检测保健食品中非法添加的13 种化学降糖药的液相色谱串联质谱分析方法并用于实际样品检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

11 种降血糖保健食品：包括粉剂、胶囊剂、软胶囊剂，6 种样品来源于市场抽检样品，5 种样品购于武汉市3 家药房。

甲醇（色谱纯）：Fisher chemical；甲酸、乙酸铵（分析纯）：国药集团。

盐酸二甲双胍（100922-201001）、盐酸苯乙双胍（100664-201203）、盐酸罗格列酮（100673-200401）、格列吡嗪（100281-201203）、盐酸吡格列酮（100634-201202）、格列齐特 （100269-201004）、格列波脲（520026-201401）、格列本脲（100135-201105）、格列美脲（100674-201102）、格列喹酮（100280-201002）、瑞格列奈（100753-201303）：以上对照品均来自中国食品药品检定研究院；盐酸丁二胍（CDAA-740015-100 mg，S0480010）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲苯磺丁脲（C17589900，G154774）：德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 仪器与设备

API4000 高效液相色谱-串联质谱仪：美国ABSciex 公司；PURELAB classicMillipore/Simplicity 超纯水机：Merck Millipore；XS105DU 电子天平：METTLER TOLEDO；JPCQ1028 超声波清洗器：武汉嘉鹏电子有限公司；L530 离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

精密称取试样1 g 至50 mL 容量瓶中，加入甲醇适量，超声20 min，冷却至25 ℃，用甲醇准确定容，摇匀，3 000 r/min 离心10 min，精密量取5.0 mL 上清液至50 mL 容量瓶中，以初始流动相（甲醇∶水，体积比40 ∶60）稀释至刻度，用 0.22 μm 滤膜滤过，上清液供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.2 对照品溶液的配制

精密称取13 种降糖类化学物质对照品各10.0 mg，分别置于25 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，冷却至25 ℃，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照储备液，置于-4 ℃冰箱中保存。临用时，精密量取各对照储备液1.0 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取该溶液5.0 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得混合标准使用液。精密量取混合标准使用液 0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别置10 mL 容量瓶中，加初始流动相（甲醇∶水，体积比 40 ∶60）至刻度，摇匀，即得浓度为 2、5、10、20、50、100 ng/mL 混合标准系列溶液。

1.3.3 色谱与质谱条件

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP 色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相 A：10 mmol/L 乙酸铵+0.1 %甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序见表1。

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization positive，ESI+）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；喷雾电压：5 500 V；去溶剂温度：500 ℃；气帘气：40 ps（i1 psi=6 895 Pa）；雾化气：50 ps（i1 psi=6 895 Pa）；辅助加热气：50 psi；定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞气能量见表2。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

表2 保留时间和主要质谱参数Table 2 Retention time and LC-MS/MS parameters

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

2.1.1 线性范围和定量限

按照优化好的色谱和质谱条件测定混合标准系列溶液，以目标物的质量浓度x（ng/mL）为横坐标，以定量离子对的峰面积y 为纵坐标，绘制标准曲线，确定方法的定量限（limits of quantitation，LOQ）。回归方程、线性范围、相关系数和定量限见表3。

表3 线性范围、回归方程、定量限、加标回收率和相对标准偏差Table 3 The linear ranges，regression equations，limits of quantitation，recoveries and relative standard deviations

由表3 可见，本方法检灵敏度高、相关性好，适用于13 种化学降糖药物的定量分析。

2.2 色谱条件优化

液相流动相的组成不仅会影响到目标化合物的保留时间和峰形，还会影响到离子化效率，从而影响检测灵敏度。经查阅相关文献[14-17]，本方法首先比较了甲醇-水溶液、甲醇-0.1 %甲酸水溶液 2 种流动相，结果表明在酸性条件下不仅可以提高目标物的离子化程度，还可以改善峰形，因此选取加入甲酸的流动相。进一步比较甲醇-0.1 %甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1 %甲酸）、甲醇-10 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1 %甲酸）、甲醇-20 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）4 种流动相，结果表明甲醇-10 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）为流动相时，各目标物峰型较好，响应较高。通过不断摸索色谱柱梯度洗脱程序，13 种目标物在15 min 内得到很好的分离。图1 为空白基质样品中添加13 种降糖类化学药物（测得浓度为2 ng/mL）的提取离子色谱图。

图1 空白样品基质中添加13 种降糖类化学药物（浓度为2 ng/mL）的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of a blank spiked with 13 kinds of drugs at 2 ng/mL

2.3 质谱条件优化

由于保健食品中复杂基质的影响，质谱检测有时候还是有假阳性现象产生，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC，在使用质谱进行确证时，需满足最低4 个识别点数。对于低分辨四级杆质谱，前体离子识别点数记为1，MSn每个特征子离子识别点数记为1.5，因此，需要1 个前体离子和2 个MSn子离子才能达到4 个识别点数的要求[18]。本研究结合文献报道[19-22]，首先在电喷雾离子源正离子模式下，对13 种目标物的单标溶液进行全扫描，获得稳定的母离子，选取[M+H]母离子进行二级碰撞，每个化合物至少选取3 对离子进行测定，以丰度最高的子离子作为定量离子，另外两对离子作为定性离子，13 种降糖类药物用于确证的二级离子数目均为3 个，识别点数均为5.5，远高于欧盟法案2002/657/EC 对于识别点数的要求，表明该方法有较强的专属性和较好的定性能力。本研究对每种目标降糖类化学药3 个离子对的去簇电压和碰撞能量等参数进行了优化，最终确立了1.3.3.2 的质谱条件。

2.4 样品提取方法的优化

批准件2009029 薄层色谱法、高效液相法、高效液相色谱-质谱联用法都为苯乙双胍和二甲双胍建立单独的样品提取系统，三氯甲烷用于提取除苯乙双胍和二甲双胍以外的另外9 种成分，三氯甲烷提取剩余的滤渣挥干三氯甲烷后用甲醇提取苯乙双胍和二甲双胍，另外，三氯甲烷提取液进液相色谱仪及液相质谱仪之前均需蒸干后加甲醇溶解，耗时且繁琐。为减少操作步骤及获得尽可能高的提取效率，本文优化了超声提取方式。分别考察了不同提取溶剂（甲醇、三氯甲烷）和不同提取时间（10、15、20、25、30 min）条件下的提取效果。结果表明，以甲醇为提取溶剂、超声提取20 min 的提取效率最高，待测定成分提取完全。

2.5 实际样品的检测

应用本方法对11 种降糖类保健食品进行了分析测定，结果见表4，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC 法案进行了定性确证。发现非法添加化学降糖药物5 种，且均为复合添加。2 种样品添加二甲双胍，5 种样品添加苯乙双胍，2 种样品添加罗格列酮，1 种样品添加甲苯磺丁脲，1 种样品添加吡格列酮，5 种样品添加格列本脲；5 种样品均为复合添加，添加2 种降糖类化学药品的为2 种，添加3 种降糖类化学药品的为1 种，添加4 种降糖类化学药品的为1 种，添加5 种降糖类化学药品的为1 种。结果表明本方法能够满足同时检测宣称辅助降血糖类保健食品中非法添加的13 种化学降糖药物的定性和定量分析要求，基质干扰较小，具有实际应用意义，可及时有效的为监管服务。

表4 样品含量测定Table 4 Determination of 13 kinds of illegal drugs in 11 samples

续表4 样品含量测定Continue table 4 Determination of 13 kinds of illegal drugs in 11 samples

3 结论

本文通过对方法的提取溶剂、色谱、质谱等条件的优化，建立了一种采用甲醇超声提取，同时检测保健食品中非法添加的13 种化学降糖药的液相色谱串联质谱分析方法并用于实际检测。该方法操作简便、快速可靠、灵敏度高等特点，提高了降糖类中成保健食品中非法添加物检测工作的效率，可用于监测保健食品中添加降糖类化学药物的情况，为市场监管提供强有力的技术支持；对保证消费者用药安全具有较强的现实意义。