高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定焙烤食品中10种添加剂

2019-10-12刘益锋李蓉刘恭源张朋杰容裕棠张宪臣胡仪光

食品研究与开发 2019年19期

刘益锋，李蓉，刘恭源，张朋杰，容裕棠，张宪臣，胡仪光

（中山海关技术中心，广东中山528400）

我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]中食品添加剂的定义：为改善食品品质和色、香、味，以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质。在焙烤食品中，食品添加剂也都发挥着各自实际的作用与价值。GB 2760-2014 中明确规定焙烤食品中允许添加的色素和甜味剂种类和限量。有些食品生产者为节约成本，超量添加合成色素和甜味剂，给人民健康带来威胁，因此，有必要建立高灵敏、准确、快速的筛查检测方法[2]。

目前，已有检测合成色素和甜味剂类物质的标准[3-6]，测定方法主要有离子色谱法（ion chromatography，IC）[7-8]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]和液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ，HPLC-MS/MS）[11-17]等，现阶段合成色素和甜味剂的检测大多使用液相色谱法。但这些传统的方法检出限较高，并且无法从根本上解决基质干扰的问题，容易出现假阳性的结果。目前尚未见采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定焙烤食品中合成色素和甜味剂的报道，四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（high resolution mass spectrometer，HR/MS）具有分辨率高及定量能力好的优点，高分辨质谱可以利用目标物母离子的精确分子量直接定量，无需对目标物逐个优化子离子及相关参数，对于多个目标物分析可以极大地降低检测的时间，同时又能很好地避免受基质干扰而产生假阳性的现象。并且静电场轨道阱高分辨质谱具有基于数据库的多种未知物的筛查功能，适用于对食品中多种有害物进行快速筛查[18-20]。

本研究建立超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定焙烤食品中10 种合成色素和甜味剂。通过建立该方法，可以对进出口焙烤食品进行有效把关，同时对保障国内焙烤食品的质量安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亮蓝（Lot.17001）、酸性橙Ⅱ（Lot.17001）、新红（Lot.17001）、柠檬黄（Lot.17001）、苋菜红（Lot.17001）、胭脂红（Lot.17001）、诱惑红（Lot.17001）标准溶液（0.5 mg/mL）：中国计量科学研究院；糖精钠（Lot.G134259）、安赛蜜（Lot.G129941）、甜蜜素（Lot.G1319899）（纯度均大于等于 98%）：德国 Dr.Ehrensorfer。

乙腈、正己烷（色谱纯）：默克股份两合公司；乙酸铵（分析纯）：上海安谱公司。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000Q-Exactive 高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid coupled with quadrupole/exactive orbitrap mass spectrometry，UPLC-HQMS），配有 HESI Ⅱ离子源：美国Thermo Fisher 公司；Coulter Avanti J-26XP 超高速冷冻离心机：美国BECHMAN 公司；Syncore 平行定量浓缩仪、B-740 再循环冷却系统、V-700/701 真空泵：瑞士BUCHI 公司；VORTEX 3 涡旋震荡器：德国 IKA 公司；DTY-B1200 电子天平：福州华志科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取糖精钠、安赛蜜、甜蜜素标准物质约10.0 mg，于各自的10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成1.0 mg/mL 的标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

混合标准工作液：分别准确吸取适量上述准储备液配成亮蓝、日落黄、酸性橙Ⅱ、新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红和糖精钠浓度为10 mg/L 及安赛蜜、甜蜜素浓度为1 mg/L 混合标准工作液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3（3 μm，2.1 mm×150 mm）；流动相：乙腈（A）-20 mmol/L 乙酸铵溶液（B），梯度洗脱条件：0～0.5 min，5%A；0.5 min～3 min，5%～50%A；3 min～5 min，50%A；5 min～7 min，50%～90%A；7 min～7.1 min，90 %～5 % A；7.1 min～10min，5 % A。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3 质谱条件

加热电喷雾离子（heating electrospray ion source，HEIS）源温度为350 ℃；离子传输温度为320 ℃；鞘气为40 unit；辅助气为40 unit；毛细管电压为3.2 kV；离子传输管温度为325 ℃。Full scan/ddms2 扫描模式：采集范围为80 Da～1 000 Da，正负切换采集；一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500；碰撞池能量（normalization collision energy，NCE）为 20、40、60 eV，10 种添加剂的质量分析和色谱分析参数如表1 所示。

1.3.4 样品处理

准确称取2 g（精确至0.01 g）样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 20 %乙腈1 %氨水溶液，涡旋混合1 min，于 50 ℃水浴超声 20 min 提取，加正己烷 10 mL，涡旋混合1 min，然后于4 500 r/min 离心5 min，弃去有机相，取2 mL 水相转移至离心管中，10 000 r/min 离心5 min，清液过0.22 μm 有机相滤膜，供上机测定。

表1 10 种添加剂的质量分析和色谱分析参数Table 1 Parameters of MS and HPLC for 10 additives

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

本方法对流动相的种类进行了考察。比较了甲醇-甲酸乙酸铵水、乙腈-甲酸乙酸铵水、甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵作为流动相时各化合物的分离情况，10 种添加剂标准物质色谱图见图1。

图1 10 种添加剂物标准物质色谱图Fig.1 Chromatograms of 10 additives

甲醇体系和乙腈体系相比较，乙腈体系分离效果更好；流动相中加入甲酸后对色素的峰形和保留时间影响较大，有些峰分裂；流动相中加入乙酸铵后色谱峰峰形得到明显改善；并对乙酸铵的浓度进行了进一步考察，结果表明流动相中乙酸铵浓度为20 mmol/L时多数化合物色谱峰响应值较高，峰形尖锐，因此选择乙腈-20 mmol/L 乙酸铵作为流动相进行梯度洗脱。

2.2 质谱条件的优化

本方法以流动注射方式对10 种目标物在负切换离子模式下进行一级全扫描，采用Q Exactive 高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式（Full MS/dd-MS2），设定涵盖目标物的质量数范围（50 m/z～500 m/z）进行一级全扫描，并以每个化合物的理论质量数建立二级扫描的目标列表。在实际扫描过程中，当一级全扫描发现目标列表里的母离子时，且信号强度超过预设值后，就会触发数据依赖子离子扫描模式，进而获得对应母离子精确质量数的二级离子全扫描质谱信息。欧盟EC 2002/657 号文件对多级质谱确证时的碎片类型和识别点有明确规定，禁用物质确证须有4 个识别点，在高分辨质谱中，母离子的识别点为2.0，子离子的识别点为2.5，因此只需一个母离子和一个子离子即可对目标物确证。通过10 种甜味剂和合成色素的二级质谱全扫描获得碎片离子信息，以实现定性确证，避免检出假阳性或假阴性样品的情况发生。

2.3 前处理方法优化

试验发现如果单独采用纯水体系和乙腈-水体系对待测物进行提取，色素类物质的回收率均不太理想，波动较大，这可能由于色素类物质大多为苯磺酸钠型，只有促进其电离，才能在极性的乙腈-水体系中得到较好的萃取结果，故考虑向体系中添加一定的氨水溶液，增加色素类物质在萃取溶液中的电离度进行回收试验。试验考察了0、0.5%、1%、2%（体积分数）氨水对萃取效果的影响，结果表明：随氨水含量的增加，色素类物质的回收率有一定提高，但是超过1%后，由于提取杂质的增加，以及样品中氨影响检测物质电离，色素类物质的回收率波动较大，有时回收率超过200%，严重影响分析结果，也影响到部分甜味剂的萃取和出峰效果，综合考虑各待测物的萃取效率，通过试验比较，选择含1%氨水的乙腈（氨水∶乙腈=20 ∶80，体积比）溶液作为提取剂。为了减少操作步骤及提高提取效率，采用超声提取方式对样品进行提取。同时考察了不同提取时间和和提取次数的提取效果，确定用20 mL 20%乙腈1%氨水溶液，在50℃水浴超声提取20 min。

2.4 线性范围与检出限

在高分辨质谱的分析中，其提取的精确质量数色谱图无基线噪音，因此采用传统信噪比方法无法定义方法的检出限。本方法采用基质标准曲线的y 轴截距除以斜率的标准偏差的3.3 倍以上数据确定检出限。准确量取适量混合标准储备工作液，用乙腈水溶液（乙腈∶水=10 ∶90，体积比）稀释成一系列浓度梯度的标准品工作液，在1.3 节条件下依次测定。结果显示各种化合物在质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均大于 0.995，检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）见表2。

表2 各化合物的回归方程、线性范围、相关系数及检出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of each compound

2.5 方法的回收率、精密度

用空白饼干、面包、月饼样品进行添加回收率和精密度试验。称取2 g（精确至0.01 g），选取低、中、高3 个合适浓度分别添加标准溶液，每个加标水平平行测定3 次，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表3。

表3 方法的回收率和相对标准偏差Table 3 The recovery rate and RSD of the method

从表3 可以看出，各组分的回收率均在64.5%～119.5%之间，相对标准偏差在3.5%～9.8%之间（n=6），可见本试验方法的准确度与精密度良好。

2.6 样品测定

利用本研究建立的分析方法检测18 批实际样品（其中包括6 批月饼样品、4 批饼干样品、2 批面包和6批糕点），其中在1 批饼干样品中检出安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、柠檬黄和亮蓝，检出量分别为0.02、0.02、0.02、0.76 mg/kg 和 1.05 mg/kg。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定了允许焙烤食品使用安赛蜜、甜蜜素的最大使用量（烤食品中安赛蜜最大使用量0.3 g/kg、面包、糕点中甜蜜素的最大使用量1.6 g/kg、饼干中甜蜜素的最大使用量0.65 g/kg），而糖精钠、柠檬黄、和亮蓝属于在焙烤食品中不得使用的添加剂（人工合成色素除焙烤食品馅料及表面用挂浆和糕点上的彩装外）。可见市场上确实存在焙烤食品违法使用添加剂的现象，建议有关部门加强监管，以保障人民身体健康。