二甲双胍减缓2型糖尿病小鼠非酒精性脂肪肝的作用

王一春 沈扬 刘萍

宁夏医科大学总医院内分泌科（银川750004）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代谢紊乱为主要临床表现的一种慢性代谢疾病［1］。近年来糖尿病的患病率和病死率逐年上升，对人类健康构成了严重的威胁。有研究发现，糖尿病与非酒精性脂肪肝（non alcohol fatty liver disease，NAFLD）的发生密切相关［2］，糖尿病患者NAFLD的发病风险是一般人群的3倍［3］，目前除生活干预外，并未发现有效治疗NAFLD的方法［4］，NAFLD作为糖尿病的主要慢性并发症之一，已逐渐受到人们的关注。

二甲双胍由于其降糖效果好、无肝肾毒性、心血管保护作用等优点，已成为公认的临床一线降糖药［5］。已有研究证实，二甲双胍对NAFLD有一定的治疗作用［6］，但其延缓NAFLD进展的作用机制尚未明确。本研究通过动物实验，研究二甲双胍对T2DM小鼠NAFLD发生发展的影响并探讨其作用机制，为二甲双胍临床应用的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂盐酸二甲双胍（A14202005856）购自北京京丰制药集团有限公司；AMPKα1（BS1010）、p-AMPKα1（BS4010）抗体均购自美国 Bioworld公司；ACC（bs-11912R）、p-ACC（bs-3039R）、HIF-1α（bs-0737R）、GAPDH（bs-2188R）抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司。AST（C0010-2）、ALT（C009-2）试剂盒均购自南京建成生物工程所有限公司。

1.2实验动物与分组自发肥胖T2DM db/db小鼠和正常db/m小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性，体质量18～21 g，4～6周龄，SPF级。饲养与实验均在宁夏医科大学实验动物中心。db/db小鼠适应性饲养1周后，剪尾取血法测定血糖，筛选出糖尿病小鼠20只，随机分成2组，即糖尿病模型组和二甲双胍组，每组10只；以10只同周龄的雄性正常db/m小鼠为正常对照组。糖尿病模型组和正常对照组灌胃蒸馏水，二甲双胍组灌胃二甲双胍（0.16 g/kg），各组均每天灌胃1次，连续给药8周，8周后处死取出肝脏组织［7］。1.3HE染色取相同部位肝脏组织，中性福尔马林固定液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，3 μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水浸洗。常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，200倍光镜下观察肝脏组织形态学变化。

1.4外周血天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测末次给药后，吸入麻醉小鼠，迅速摘取眼球取血于1.5 mL EP管中，分离血清。微板法测定各组小鼠血清中AST和ALT的水平。

1.5免疫组化检测石蜡包埋的肝脏组织经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水浸洗，抗原修复后，一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗37℃孵育1 h，PBS冲洗3次，DAB显色，复染，梯度酒精脱水，二甲苯使切片透明，中性树胶封片，400倍光镜下观察蛋白表达情况。应用Image-Pro Plus 6.0图像处理系统测量各组蛋白的平均光密度。

1.6Western Blot检测提取100 mg小鼠肝脏组织，加入蛋白裂解液，BCA法测定总蛋白浓度。定量上样蛋白（按照60 μg），加5×上样缓冲液，蛋白变性、电泳、转膜、10%脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗4℃孵育过夜，次日复温1 h，二抗37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，加入超敏ECL化学发光剂显影。采用Image J图像处理系统测量各样本条带灰度值。1.7统计学方法采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料均采用均数±标准差的形式表示，多组样本均数间的比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组小鼠肝脏组织形态的比较HE染色显示，正常对照组小鼠肝细胞结构正常，肝小叶结构清楚，肝细胞索排列整齐，无炎性细胞和脂滴浸润。糖尿病模型组出现弥漫性肝细胞大泡性脂肪变，肝细胞索排列紊乱，体积增大，呈空泡状，胞质中出现大量脂滴。二甲双胍组肝小叶结构较清楚，胞质内脂滴较糖尿病模型组明显减少。见图1。

2.2各组小鼠血清中AST、ALT表达情况二甲双胍组AST、ALT水平较糖尿病模型组明显降低，差异均有统计学意义（F=22.994，56.892，均P＜0.01）。见表1。

2.3免疫组化法检测各组小鼠肝脏组织中蛋白表达情况

2.3.1各组小鼠肝脏组织中AMPKα1蛋白表达情况正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组小鼠肝脏组织中AMPKα1蛋白相对表达量分别为（0.135 ± 0.043）、（0.124 ± 0.015）、（0.153 ± 0.126），差异具有统计学意义（F=81.106；P＜0.01），二甲双胍组AMPKα1蛋白表达量明显高于其他组。见图2。

图1 小鼠肝脏组织形态学观察（HE染色，×200）Fig.1 Histological observation of liver in mice（HE Staining，× 200）

表1 各组小鼠血清中AST、ALT表达水平Tab.1 Expression of AST，ALT in serum of mice in each group ±s，U/L

表1 各组小鼠血清中AST、ALT表达水平Tab.1 Expression of AST，ALT in serum of mice in each group ±s，U/L

注：与正常对照组相比较，*P＜0.05；与糖尿病模型组相比较，#P＜0.05

分组正常对照组糖尿病模型组二甲双胍组AST 4.738±0.751 8.486±0.922*5.548±0.329#ALT 3.502±1.266 15.690±1.223*9.091±1.671*#

2.3.2各组小鼠肝脏组织中ACC蛋白表达情况正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组小鼠肝脏组织中ACC蛋白相对表达量分别为（0.190±0.084）、（0.232±0.599）、（0.143±0.385），差异具有统计学意义（F=144.146，P＜0.01），糖尿病模型组ACC蛋白表达量明显高于其他处理组。见图3。

2.3.3各组小鼠肝脏组织中p-ACC蛋白表达情况正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组小鼠肝脏组织中p-ACC蛋白相对表达量分别为（0.213± 0.110）、（0.140 ± 0.254）、（0.280 ± 0.325），差异具有统计学意义（F=24.317，P＜0.01），二甲双胍组p-ACC蛋白表达量明显高于其他组。见图4。

图2 免疫组化法检测各组肝脏组织中AMPKα1蛋白表达情况（×400）Fig.2 Detection of AMPK α 1 protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

图3 免疫组化法检测各组肝脏组织中ACC蛋白表达情况（×400）Fig.3 Detection of ACC protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

图4 免疫组化法检测各组肝脏组织中p-ACC蛋白表达情况（×400）Fig.4 Detection of p-ACC protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

2.3.4各组小鼠肝脏组织中HIF-1α蛋白表达情况正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组小鼠肝脏组织中HIF-1α蛋白相对表达量分别为（0.168± 0.269）、（0.207 ± 0.234）、（0.149 ± 0.255），差异具有统计学意义（F=423.386，P＜0.01），糖尿病模型组HIF-1α蛋白表达量明显高于其他组（P＜0.01）。见图5。

2.4Western Blot法检测各组小鼠肝脏组织中蛋白表达情况以GAPDH为内参，采用Image J图像处理系统测量各组AMPKα1和HIF-1α蛋白表达水平，并计算与内参条带灰度值的比值（图6A），结果显示，二甲双胍组AMPKα1蛋白表达水平和磷酸化水平明显高于正常对照组和糖尿病模型组，差异具有统计学意义（F=73.197，483.402；均P＜0.01）。糖尿病模型组ACC蛋白表达水平高于正常对照组和二甲双胍组，而二甲双胍组ACC磷酸化水平高于其他组，差异具有统计学意义（F=383.751，390.177；均P＜ 0.01）。糖尿病模型组HIF-1α蛋白表达水平高于正常对照组和二甲双胍组，差异具有统计学意义（F=634.345，P＜0.01）。见图6。

3 讨论

近年来，T2DM引起的各种并发症是糖尿病患者致死致残的主要原因，非酒精性脂肪肝在人群中的患病率逐年升高，已成为引起我国慢性肝病发生的主要病因之一。有研究发现，T2DM所致的代谢紊乱是NAFLD发病的高危因素，T2DM与NAFLD的发生密切相关［8］。二甲双胍作为一线降糖药在临床上广泛使用，不仅降糖效果好，在抑制糖尿病并发症的发生方面也有巨大作用［9-10］。目前二甲双胍在糖尿病患者肝损伤中的保护作用已受到人们广泛关注，但其作用机制尚不完全清楚。

图5 免疫组化法检测各组肝脏组织中HIF-1α蛋白表达情况（×400）Fig.5 Detection of HIF-1α protein expression in liver tissues of all groups by immunohistochemical method（× 400）

图6 Western Blot法检测各组肝脏组织中AMPKα1、p-AMPKα1、ACC、p-ACC和HIF-1α蛋白表达情况Fig.6 Detection of AMPKα1，p-AMPKα1，ACC，p-ACC and HIF-1α protein expression in liver tissues of all groups by Western Blot

本研究发现糖尿病模型组小鼠肝脏组织中出现弥漫性肝细胞大泡性脂肪变，二甲双胍干预后肝细胞脂肪变性情况明显减轻，胞质内脂滴数量明显减少，提示T2DM可能与NAFLD的发生密切相关，二甲双胍可能通过改善糖尿病小鼠脂代谢紊乱，减少肝脏组织脂肪含量，进而减缓NAFLD的发生。有研究发现，二甲双胍可以下调糖尿病小鼠肝组织中的脂质水平，防止糖尿病引起的代谢紊乱，减轻肝脏脂肪变性和病理损伤［11］。此外，本研究糖尿病模型组AST、ALT明显高于其他组，二甲双胍干预后AST、ALT水平明显降低，血清AST水平反映肝细胞功能、ALT水平反映肝脏脂肪沉积的状况，表明二甲双胍可能改善糖尿病小鼠的肝功能，减少肝细胞脂肪沉积，这与ROZANA等［12］的研究结果一致。但是，本研究并没有探讨二甲双胍对肝细胞增殖和凋亡的影响，后续将进一步开展。

目前二甲双胍在糖尿病患者肝损伤保护作用中的机制尚不完全清楚，本研究发现二甲双胍组AMPKα1、p-AMPKα1、p-ACC蛋白表达水平明显高于其他组，而ACC蛋白表达水平明显低于其他组，提示二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路，促进ACC蛋白磷酸化，改善糖尿病小鼠脂代谢紊乱，减缓NAFLD的发生。有研究报道，二甲双胍作为AMPK激活剂，通过激活AMPK信号通路，促进ACC蛋白磷酸化，使ACC蛋白失活，抑制肝糖异生和胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成，加速脂肪酸氧化，减少脂肪酸的堆积，进而减缓NAFLD的发生［13］。此外，本研究还发现，二甲双胍组HIF-1α蛋白表达水平明显低于其他组，表明二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路抑制HIF-1α蛋白表达，降低游离脂肪酸的合成速度，减少脂质在肝脏中的沉积。糖尿病患者由于氧需增加、供氧不足处于缺氧状态，而缺氧可以诱导HIF-1α表达，促进游离脂肪酸的合成，减少肝脏脂肪代谢，增加脂质在肝脏中的沉积，进而促进NAFLD的发生［14-15］，当AMPK激活时可能通过抑制mTOR复合物的功能进而达到调节HIF-1α蛋白合成的作用［16］。

综上所述，T2DM与NAFLD的发生发展密切相关，二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路、促进ACC蛋白磷酸化，抑制HIF-1α表达，降低游离脂肪酸合成速度，加速脂肪酸氧化，减少脂肪酸堆积，进而起到减缓NAFLD发生的作用。