膜结合态多酚氧化酶生物学信息分析

刘 芳 韩倩云 倪元颖*

（1西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌 712100

2中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083）

多酚氧化酶（PPO）是苹果褐变的关键酶[1]。随着研究的深入，研究者发现PPO不仅导致果蔬的褐变，其在植物逆境胁迫防御[2]、次生代谢及细胞死亡方面都有着非常重要的作用[3]。有研究表明：PPO可分为可溶态和结合态，苹果中可溶态只占8%～15%[4-5]。Guardo等[6]研究表明新鲜苹果加工中褐变与PPO的表达相关，利用蛋白组学技术研究苹果褐变机理，发现一个新的基因型（Md-PPO）与褐变差异性相关。Mellidou等[7]通过基因技术研究苹果采后贮藏中果肉褐变机理，发现两种PPOs被诱导。综上研究表明苹果褐变问题与PPO存在形式密切相关。国内外对游离态多酚氧化酶生理、生化特性方面的研究取得了较多成果，而对膜结合态多酚氧化酶（mPPO）在褐变中的作用以及其对果实伤害褐变的调控研究甚为缺乏。蛋白质的结构是其功能的分子基础，了解蛋白质的结构，对理解、揭示蛋白质的功能具有重要指导意义[8]。在蛋白质组学的研究中，对膜蛋白知之甚少，解析膜蛋白结构，研究膜蛋白功能是当前生物学领域最前沿的研究热点之一。目前已知跨膜蛋白三维结构的只有少数几种[9]。由于膜蛋白疏水结构域的存在，蛋白在水相环境中容易聚合，使膜蛋白的纯化和结晶较为困难，这是膜蛋白结构解析的最主要瓶颈之一[10]。David[11]试图从氨基酸序列和结构来预测蛋白质功能。Johannes Hermann等[12]在《Nature》杂志封面文章上提出，对于一种未知功能的酶，基于结构来预测其活性的可能性。

mPPO活性远远高于可溶态多酚氧化酶，其对果蔬生产及贮藏影响巨大，对mPPO分子特性及结构的研究非常重要[13]。本文对富士苹果中mPPO的生物学信息进行预测，分析其二级结构、疏水性、跨膜结构及亚细胞定位等，为研究苹果中mPPO的生物特性及结构特性提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

以实验室前期分离纯化的膜结合态多酚氧化酶一级结构为基础，进行生物信息学分析。

1.2 理论方法和步骤

1.2.1 富士mPPO氨基酸组成及特性分析 利用Geneva 大学 Expasy 站点（http：//expasy.org/）中的ProtParam程序分析mPPO蛋白的氨基酸组成（http：//web.expasy.org/protparam/）。利用中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心软件（http：//www.biosino.org/pages/protein2.htm）分析mPPO理化特性。

1.2.2 富士mPPO二级结构预测分析 采用Expasy 站点（http：//expasy.org/）的各种软件及各种结构预测软件，根据所得到的氨基酸序列对蛋白质结构进行预测分析。采用ExPASy中的GOR（Gamier-Osguthorpe-Robson）二级结构预测工具（网址：https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）对mPPO的二级结构进行预测。

1.2.3 富士mPPO疏水性分析 疏水性分析软件ExPASy 中 的 ProtScale 程 序（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）可用来计算蛋白质的疏水性图谱，本论文利用此程序对富士苹果中mPPO进行疏水性分析。

1.2.4 富士mPPO跨膜分析 根据蛋白质氨基酸序列，借助Expasy中的TMPRED对mPPO蛋白的跨膜区、是否含有信号肽以及是否位于膜内细胞质等进行预测（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htm）。对于TMpred给出的结果，结合伦敦大学PSIpred程序（protein structure prediction server，网 址：http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）对预测跨膜结构综合分析，以得到较为合理的结果。

1.2.5 富士mPPO亚细胞定位 利用分析预测软件 targetp v1.1 server（网址：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/），预测富士苹果中mPPO的亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 富士mPPO氨基酸组成及特性分析

ProtParam程序对富士mPPO氨基酸组成的分析结果如图1所示。

图1 mPPO的氨基酸组成分析Fig.1 The amino acids composition of mPPO

如图1所示，mPPO的氨基酸含量最多的为Thr（8.7%），其次为 Asp（7.8%）、Leu（7.8%）、Lys（7.5%）和Ala（6.7%）。不含 Pyl和Sec。对 PPO 功能起重要作用的组氨酸（His）含量为2.5%。疏水性氨基酸通常存在于蛋白质内部，避免与外界水溶液接触；其中mPPO中疏水性氨基酸所占比例分别为：Met（蛋氨酸 1.5%）、Trp（色氨酸 1.3%）、Phe（苯丙氨酸 4.8%）、Val（缬氨酸 5.0%）、Leu（亮氨酸7.8%）、Ile（异亮氨酸 4.7%）、Pro（脯氨酸 7.2%）和Ala（丙氨酸6.7%）。亲水性最强的两种氨基酸分别是Arg（精氨酸4.2%）和Lys（赖氨酸7.5%）。从氨基酸组成可看出，mPPO中疏水性氨基酸占比例为40%以上。mPPO理化特性分析结果如表1所示。

表1 mPPO的理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of mPPO

不稳定性系数是表示蛋白稳定性的参数。经统计分析发现，与稳定性蛋白质相比，在不稳定性蛋白质中有一些二肽出现的频率明显不同。由此设计了400个不同二肽不稳定性重量值，经计算机分析不稳定性系数。当一个蛋白质的不稳定系数大于40时，则该蛋白质不稳定。脂肪系数是一个蛋白质中脂肪侧链所占的相对值，脂肪系数可作为球蛋白热稳定性增加的阳性因素。

从检索结果看，mPPO的理论稳定指数为41.72（不稳定系数小于40为稳定，大于40为不稳定），表明这种蛋白为不稳定蛋白。GRAVY值通常可以用来表征蛋白质的疏水性，其范围一般在2与-2之间。疏水蛋白的GRAVY值为正值，亲水蛋白的GRAVY值则为负值[14]。mPPO的GRAVY值为-0.540，为负值，表明这种蛋白为亲水蛋白。虽然此分值很有用，但是如果没有hydropathy plot的协助是不能够可靠地预测结构的。脂肪簇指数也可以表征蛋白质的疏水性，脂肪簇指数越大，则表明疏水性越强。结果显示mPPO的脂肪簇指数为70.03。根据hydropathy plot对mPPO疏水性质的分析结果及图3（mPPO的溶剂可接近性分析），综合分析得出，苹果中mPPO为表面疏水性蛋白。

富士苹果mPPO的溶剂可接近性分析结果如图2所示。溶剂可接近性是代表蛋白内氨基酸暴露于构象蛋白表面程度的一个指标。从图2可看出，暴露表面的残基为45.74%，埋藏内部的氨基酸残基为47.08%。

2.2 富士mPPO二级结构预测分析

图2 mPPO蛋白溶剂可接近性（利用PredictProtein seartificial预测）Fig.2 Solvent accessibility of mPPO by PredictProtein seartificial

蛋白质二级结构可看作是多肽链的局部构象，指蛋白质多肽链的折叠和盘绕的方式，主要由近程作用力形成，常见的二级结构类型主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和凸起等几种形式，是构成蛋白质三级结构的基本元素，相邻二级结构之间通过一些无规则的卷曲连接成一个完整的三级结构[15]。对蛋白质二级结构的预测算法，目前最好的单序列预测程序能够达到70%左右。基于information theory的GOR IV准确度可达到69.7%。基于神经网络的为76%～77%。但隐马尔科夫模型（HMM）预测结果准确度不高[16]。本论文利用PredictProtein seartificial（基于人工神经网络，ArtificialNeural Networks，简写为 ANNs）和GOR 算法分别对富士苹果mPPO二级结构进行了预测，结果如图3、图4所示。

图3 利用PredictProtein seartificial预测的mPPO二级结构（红色为α螺旋，黄色为β折叠）Fig.3 The secondary structure map of mPPO by PredictProtein seartificial

图4 二级结构预测Fig.4 The secondary structure map of mPPO

GOR算法是单序列预测方法中的一种，这种方法以信息论为基础，属于统计学方法的一种，而且是所有统计算法中理论基础最好的。GOR方法同时考虑被预测位置本身氨基酸残基种类对该位置构象的影响及相邻残基种类对该位置构象的影响两个方面，物理意义清楚明确，数学表达严格，预测的成功率提高到70%左右[17]。富士苹果中mPPO二级结构各构象组成比例如表2所示。结果表明，mPPO二级结构中的α-螺旋为18.67%，而β-折叠结构含量为23.33%，剩余的无规卷曲则为58.00%。预测的结果中，mPPO蛋白不含310螺旋、Pi螺旋、β-桥、β-转角、弯曲结构，以及其他结构。

表2 mPPO的二级结构预测Table 2 Secondary structural content prediction of mPPO by GOR

2.3 富士mPPO疏水性分析

富士苹果中mPPO疏水性分析结果如图5所示。

图5中，横坐标为序列位置，纵坐标为氨基酸的标度值。Hphob.kyte&Doolittle标度定义疏水性氨基酸较高的打分值（大于0值表示疏水性，小于0值表示亲水性）。从图上我们可看出，mPPO分值在0以上，为疏水性蛋白。

2.4 富士mPPO跨膜分析

根据蛋白质氨基酸序列，借助Expasy中的TMPRED对mPPO蛋白的跨膜区、是否含有信号肽以及是否位于膜内细胞质等进行预测，结果如表3、表4及图6所示。

图5 GFAP亲疏水性分布图Fig.5 GFAP affinity-disaffinity water distribution

表3 TMPRED预测的跨膜螺旋信息Table 3 Possible transmembrane redions and orientation

表4 跨膜拓扑结构模型信息Table 4 Possibie models considered，only significant TM-segments used

TMpred对提交的蛋白序列给出了两种可能的结果，一种是先从外面到内，一种是先从内到外。从表3及表4分析可知，最优的跨膜拓扑结构有两个：8～33（从外到内）和83～105（从内到外）。对于TMpred给出的结果，结合伦敦大学PSIpred程序（protein structure prediction server）对预测跨膜结构综合分析，以得到较为合理的结果。

从图6可看出，PSIpred软件预测mPPO中存在一段信号肽段，在肽段前面和后面各有一个跨膜结构。具体的跨膜信息如图7所示。

图6 PSIpred软件预测的mPPO跨膜结构Fig.6 Schematic diagram of the MEMSAT3 and MEMSATSVM predictions for the query sequence

图7 PSIpred软件预测的mPPO跨膜肽段方向Fig.7 The cartoon of MEMSATSVM and MEMSAT3

从图7可看出，mPPO是一个膜整合蛋白，大部分肽段位于细胞质中，在肽段的1～39氨基酸残基为信号肽，82～97为N-端的一段跨膜肽段（由外到内），而548～567为C端的一段跨膜肽段（由内到外）。这与TMpred的预测结果一致，但跨膜肽段的氨基酸具体位置有所差异。

2.5 富士mPPO亚细胞定位

富士苹果中mPPO的亚细胞定位预测结果如表5所示。cTP、mTP、SP分别表示叶绿体转运肽（chloroplast transit peptide），线粒体目标肽（mitochondrial targeting peptide）和信号肽（signal peptide）。Loc表示定位结果，分别为C、M和S。其中C表示叶绿体，M表示线粒体，如序列中包含线粒体靶向肽，S表示分泌路径，如序列中包含分泌通路信号肽。定位于线粒体、叶绿体的蛋白质是在游离核糖体上合成的，合成后由引导肽将蛋白质导向靶位点。cTP或mTP值接近1，表明蛋白质位于叶绿体或线粒体。RC值（Reliability class）表示预测的差异性，分为 5 级（1，2，3，4，5），数值越小表示预测结果越准确。表5预测定位结果表明，富士苹果中mPPO位于叶绿体。

表5 mPPO的亚细胞定位结果Table 5 The sub-cellular localization results of mPPO

对于植物体中PPO的定位，尚无一致意见（或认为定位于类囊体PPO或者与类囊体膜相结合，或是溶解在膜腔中）。果蔬细胞组织中PPO存在的位置因果蔬的种属、品种及成熟度的不同而不同，研究表明，有活性的PPO常分布于正常细胞的质体中[18]。茶叶中的PPO分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态；新鲜苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。刘乾刚[19]认为细胞壁也可能存在PPO。有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶。但也有人认为含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中[20]。就PPO组织定位来讲，其广泛存在于植物的各器官和组织，如花器官、分生组织、叶片、块茎、根中，一般在幼嫩部分含量较多，而在成熟部分较少。Hunt等[21]报道，马铃薯叶片中只在幼嫩叶片中能检测到，而且从顶芽到第11个叶芽中的PPO分布是恒定的。Dry等[22]报道，葡萄幼嫩的正在生长的浆果、叶片、根中有高水平的PPO基因表达，而在成熟组织中却较少。

3 结论

富士苹果mPPO位于叶绿体膜上，为疏水性膜整合蛋白，其大部分肽段位于细胞质中，肽段的1～39氨基酸残基为信号肽，82～97为N-端的一段跨膜肽段（由外到内），而548～567为C端的一段跨膜肽段（由内到外）。mPPO二级结构中的α-螺旋为18.67%，β-折叠为 23.33%，无规卷曲为58.00%，不含 310 螺旋、Pi螺旋、β-桥、β-转角等结构。通过信息学分析结果分析，我们推测富士苹果mPPO与苹果生物防御功能相关，可能在信号传导过程起重要作用，与可溶态多酚氧化酶共同调控果蔬生理应急防御及褐变，这将是mPPO未来研究的重要方向之一。