食源性柚皮苷抗氧化性及其对呋喃所致小鼠肝肾损伤的保护作用

袁 媛 刘黄友 闫海洋* 孙 冶

（1吉林大学食品科学与工程学院 长春 130062

2长春市九台区鸡鸣山中心学校 长春 130500）

柚皮苷（Naringin），双氢黄酮类物质，主要存在于芸香科柑橘属植物柚、酸橘、葡萄及其变异的果实和变异的果皮中[6]，在食品工业领域用于风味改良剂和天然着色剂[7]。国内科研机构主要致力于柚皮苷对抑制癌细胞和保护正常细胞的活性作用，研究表明柚皮苷对于辐射所引起的细胞变化起到抑制作用[8]。柚皮苷作为常见的生物抗氧化剂，具有抑酶、降血压、降血糖、抗氧化、抗癌、抗衰老等药理作用；抑制癌基因表达，诱导癌细胞凋亡，抗癌细胞增殖，抗自由基等生物活性作用[9]。目前还没发现利用小鼠肝、肾损伤模型来研究和评价柚皮苷对呋喃所致损伤的保护作用。本文首先利用DPPH·法、ABTS+法、邻二氮菲-Fe2+还原法、硝基四氮唑蓝法及亚油酸过氧化法评价柚皮苷清除自由基的能力和抗氧化活性；再以小鼠为实验动物，从ROS含量变化、氧化损伤、细胞因子水平、DNA损伤和肝肾损伤相关指标揭示柚皮苷对呋喃所致小鼠肝、肾毒性的保护作用，以期为呋喃体内毒性防护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康雄性BALB/C小鼠6～7周龄，体重20 g，吉林大学动物中心提供；呋喃（CAS：110-00-9，纯度≥98%）、 柚皮苷（CAS：10236-47-2，纯度≥95%）和二甲基亚砜（CAS：67-68-5，纯度≥99%）均购于 Sigma公司（美国）；细胞活性氧（ROS）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），美国 R&D 公司提供；血清尿素氮（BUN）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清肌酐（creatinine）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原性谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）等试剂盒，购于中国南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 柚皮苷抗氧化活性分析 分别用DPPH·法[10]，ABTS+法[10]，邻二氮菲-Fe2+还原法[11]，硝基四氮唑蓝法[12]考察柚皮苷清除自由基能力；通过亚油酸过氧化法[13]考察柚皮苷的脂过氧化抑制能力。

1.2.2 实验动物设计 50只健康雄性BALB/C小鼠，随机分成5组（每组10只），分笼饲养，饲养环境：温度22℃±2℃、相对湿度30%±10%，自由采食、饮水适应性喂养一周[14]。动物分组情况如下：

对照组：用75%的生理盐水连续灌胃14 d；

呋喃染毒组（16 mg/kg/d）：用75%的生理盐水连续灌胃14 d，第8天开始以16 mg/kg/d剂量腹腔注射呋喃，连续7 d；

5 mg/kg/d柚皮苷保护组：柚皮苷以5 mg/kg/d剂量连续灌胃14 d，第8天开始以16 mg/kg/d剂量腹腔注射呋喃，连续7 d；

10 mg/kg/d柚皮苷保护组：柚皮苷以10 mg/kg/d剂量连续灌胃14 d，第8天开始以16 mg/kg/d剂量腹腔注射呋喃，连续7 d；

1.面向基层设立统战工作实践创新成果奖。中央和各省（自治区、直辖市）党委统战部门，要按照不同资源条件、不同方向原则，配备必要的专项工作经费，指导各地区县、乡（镇、街道）持续开展项目化、特色化基层统战工作品牌建设，促进基层统战工作抓手的多样化、个性化；帮助基层总结经验，提炼推广成果，促进工作创新，增强工作实效。

20 mg/kg/d柚皮苷保护组：柚皮苷以20 mg/kg/d剂量连续灌胃14 d，第8天开始以16 mg/kg/d剂量腹腔注射呋喃，连续7 d。

1.2.3 动物处理 给药14 d后，小鼠禁食24 h，眼球采血，4℃静置1～2 h，待血清析出后，2 500 r/min离心15 min，分离取血清，待测。将采血后的小鼠处死解剖，取出肝肾组织，生理盐水清洗，滤纸拭干后称重。并用组织质量9倍的生理盐水在冰水浴中研磨成浆，10%的组织匀浆3 000 r/min离心15min，取上清液待测[15]。

1.2.4 指标测定 参照试剂盒说明书，分别检测ROS、氧化损伤指标（GST、GSH 活性，SOD、MPO、MDA 含量）、细胞因子水平（TNF-α、（IL）-1β、（IL）-6、（IL）-10 含量）、DNA 损伤（8-OHdG 含量）、肝肾损伤（AST、ALT活性，BUN、LDH 及 Creatinine含量）。

1.3 数据统计分析

试验数据均采用SPSS.19软件分析差异显著性，P<0.05为差异显著，各项指标以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 柚皮苷的抗氧化活性分析

亚油酸过氧化法测定柚皮苷抑制脂质氧化试验时，当柚皮苷添加质量浓度为0.005 mg/mL时，其脂质氧化抑制率达到14.89%，结果表明柚皮苷能够抑制脂质氧化。DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力，·OH清除能力和·O2-清除能力随着柚皮苷浓度的增加，其自由基清除能力在一定范围内呈线性增加（表1）。柚皮苷对DPPH自由基，ABTS自由基，·OH和·O2-的 IC50值分别为0.853，0.809，0.037 及 0.045 mg/mL，说明柚皮苷对·OH自由基具有很强的清除能力。

2.2 柚皮苷对ROS 含量的影响

细胞活性氧（ROS）具有很强的生物活性，可通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死[16]。图1显示了小鼠血清中ROS的变化，呋喃染毒组与对照组相比，ROS含量显著升高（P<0.05），对照组与呋喃染毒组相比ROS含量从（135.32±6.21）U/mL 上升到（268.16±8.20）U/mL，而食源性柚皮苷的保护组ROS含量均下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保护组与呋喃染毒组相比，ROS含量显著下降（P<0.05），接近于对照组水平。在体外抗氧化试验中，柚皮苷对·OH（0.037 mg/mL）、·O2-（0.045 mg/mL）等 ROS 自由基具有很好的清除能力，由此看出柚皮苷可以通过降低ROS含量，缓解细胞氧化。

表1 柚皮苷清除自由基能力Table 1 Antioxidant activity of naringin against scavenging free radicals

图1 食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠ROS含量的影响Fig.1 Effects of foodborne naringin on ROS content in the serum of furan treated mice

2.3 柚皮苷对小鼠肝肾氧化损伤的影响

表2显示了小鼠肝肾组织中MPO的变化，呋喃染毒组较对照组MPO含量显著升高（P<0.05），而添加柚皮苷的保护组中MPO含量均下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保护组接近对照组水平。GST和GSH是肝肾组织的抗氧化指标，能够反应肝肾器官的氧化损伤情况。呋喃染毒组较对照组GST和GSH含量显著降低（P<0.05），其中肝对照组与肝染毒组相比GSH含量从（7.14±0.72）μmol/g降低到（3.26±0.88）μmol/g，GST 含量从（103.463±6.44）U/mg下降到（69.322±3.35）U/mg。而食源性柚皮苷的保护组GST和GSH含量均升高，其中10 mg/kg/d柚皮苷保护组的GST和GSH含量已经接近对照组水平，同时5 mg/kg/d和20 mg/kg/d柚皮苷保护组与呋喃染毒组相比较，GST和GSH含量显著升高（P<0.05）。

通过检测MDA含量可以反映机体脂质过氧化的程度[16]。呋喃染毒组与对照组相比，MDA含量明显升高（P<0.05），小鼠肾脏组织中的对照组与保护组相比较，5 mg/kg/d柚皮苷保护组（5.123 nmol/mg±0.38 nmol/mg）与 20 mg/kg/d柚皮苷保护组（4.039 nmol/mg±0.18 nmol/mg）较对照组均偏高，而10 mg/kg/d柚皮苷保护组MDA含量为3.924 nmol/mg±0.54 nmol/mg接近于对照组水平（表2）。SOD的测定常与MDA相互配合，MDA水平升高，SOD活性降低，即可引起氧化应激反应，导致细胞损伤甚至死亡。通过试验发现肾呋喃染毒组（29.925 U/mg±1.72 U/mg）较肾对照组（84.091 U/mg± 4.11 U/mg），SOD 含量明显降低（P<0.05）而柚皮苷保护组中SOD含量明显升高（P<0.05），其中10 mg/kg/d柚皮苷保护组与呋喃染毒组相比较，肝脏中由91.251 U/mg±2.1 U/mg升高到196.025 U/mg±5.6 U/mg；肾脏中由 29.925 U/mg±1.72 U/mg升高到 79.891 U/mg±3.93 U/mg，均接近于对照组水平。以上结果表明食源性柚皮苷可以通过升高SOD的含量，降低MDA含量从而对小鼠起到保护作用。

综上所述，食源性柚皮苷可以通过降低小鼠肝肾组织中MPO和MDA的含量，增加肝肾组织中GST、GSH和SOD的含量，从而降低由呋喃氧化所造成肝肾的氧化损伤。

2.4 柚皮苷对小鼠细胞因子水平的影响

从表3可以看出呋喃染毒组和对照组比较细胞因子 IL-6，IL-1β，IL-10和TNF-α 明显增加（P<0.05）。随着柚皮苷浓度的增加，IL-6水平降低，当柚皮苷质量浓度为10 mg/kg/d时，IL-6的水平从2.418 pg/m±0.096 pg/mL降低到1.183 pg/mL±0.459 pg/mL，与对照组无显著差异（P＞0.05）；10 mg/kg/d柚皮苷保护组中IL-1β和TNF-α明显降低（P＜0.05）。

表2 食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠肝脏和肾脏组织中MPO、GST、GSH和SOD含量影响Table 2 Effects of foodborne naringin on MPO，GST，GSH and SOD content of liver and kidney tissue in mice induced by furan

表3 食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠血清中IL-10、IL-1β、IL-6及TNF-α含量影响Table 3 Effects of foodborne naringin on IL-10，IL-1β，IL-6 and TNF-α content of serum in mice induced by furan

2.5 柚皮苷对DNA损伤的影响

8-OHdG是DNA氧化损伤的特异产物，我们通过检测小鼠血清中8-OHdG的含量变化来研究食源性柚皮苷对呋喃染毒小鼠血清中DNA损伤的影响。如图2所示，经呋喃染毒（16 mg/kg/d）7d后，呋喃染毒组较对照组，8-OHdG的含量明显增加（P＜0.05），达到 1.427 ng/mL±0.055 ng/mL，高出近3倍。灌胃不同浓度的柚皮苷后，小鼠血清中8-OHdG的含量变化显著说明食源性柚皮苷对呋喃染毒小鼠血清中DNA损伤具有一定的保护作用。

图2 食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠8-OHdG含量的影响Fig.2 Effects of foodborne naringin on 8-OHdG content in the serum of furan treated mice

2.6 柚皮苷对小鼠肝肾损伤的作用

如表4所示，16 mg/kg/d呋喃染毒组较对照组，ALT、AST、LDH 活性和BUN、肌酐水平明显提高（P<0.05）。研究发现，柚皮苷保护组较呋喃染毒组血清中的AST和ALT活性明显降低（P<0.05）。当用10 mg/kg/d柚皮苷灌胃小鼠后，AST活性（14.21 U/L±1.56 U/L）仍高于对照组（13.21 U/L±1.33 U/L），但10 mg/kg/d的柚皮苷保护组有效保护了呋喃所致小鼠的肝损伤。BUN是肾功能变化的一项重要指标，当机体肾脏产生病变时会导致BUN浓度升高，排泄功能发生障碍，新生代谢失调[17]。染毒组与对照组相比BUN含量显著升高（P<0.05），对照组与染毒组相比BUN含量从22.27 mmol/L±4.23 mmol/L上升到26.07 mmol/L±3.38 mmol/L，而添加食源性柚皮苷的保护组BUN含量均有所下降，10 mg/kg/d柚皮苷保护组已经接近对照组水平（表4）。LDH是一种在肾脏中含量较高的糖酵解酶，对照组与染毒组相比LDH含量从1 860.22 U/L±109.2 U/L上升到3 462.37 U/L±221.5 U/L，呋喃染毒造成了小鼠肾脏的损伤，而添加食源性柚皮苷的保护组LDH含量均有所下降，其中10 mg/kg/d柚皮苷保护组LDH含量显著下降（P<0.05）。表4中呋喃染毒组 LDH活性、BUN和肌酐水平较对照组明显增加（P<0.05）。10 mg/kg/d的柚皮苷治疗组用药14 d后，LDH活性，BUN和肌酐水平均接近于对照组水平，由此可知食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠肝肾损伤具有保护作用。

表4 食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠血清中AST、ALT、BUN、LDH及Cr含量影响Table 4 Effects of foodborne naringin on AST，ALT，BUN，LDH and creatinine content of serum in mice induced by furan

3 讨论

细胞活性氧（ROS），如超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2），和羟基自由基（·OH）与人类很多疾病息息相关。我们利用小鼠模型研究了呋喃和柚皮苷对ROS的相互影响，并结合柚皮苷体外抗氧化试验（表1）结果，可以看出柚皮苷具有一定的清除自由基如·OH和·O2-的能力，并可能对呋喃所致ROS含量降低起重要的作用。GSH作为一种重要的细胞内抗氧化剂，有助于保持细胞内蛋白质的硫醇基和生物体的抗氧化[18]。呋喃染毒组中GSH的活性在肝脏和肾脏明显下降（P<0.05），这表明GSH可能作用于呋喃诱导的氧化损伤。GST能够灵敏地反映机体损伤情况，在储存和排泄外源性化学物质的方面也起着重要的作用。呋喃染毒组较对照组，小鼠肝肾中的GST活性明显降低（P<0.05），呋喃诱导肝肾产生了一定程度的损伤。GST通过将有毒化合物代谢成无毒化合物已达到保护肝脏的目的[19]。小鼠GST活性被呋喃染毒所抑制并造成进一步伤害，然而柚皮苷的添加抑制了呋喃导致的GSH含量的降低和GST活性损伤，可以看出柚皮苷在减少呋喃诱导损伤中起重要作用。SOD，作为机体清除自由基的主要酶类[20]，能够将超氧化物离子（O2-）催化成氧气和过氧化物，在细胞抗氧化方面起着重要的作用，常被用来评价机体的抗氧化能力[21]。小鼠经16 mg/kg/d质量浓度的呋喃染毒7d后，呋喃染毒组较对照组，小鼠肝肾中SOD的活性明显降低（P<0.05），说明呋喃引起了氧化应激反应。MPO能利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基。研究表明，16 mg/kg/d呋喃染毒组小鼠，MPO活性明显增加，具有脂质过氧化作用的氧化产物出现，与蛋白质和DNA作用产生毒性和诱变[22]，造成肝肾损伤。MDA是一种可通过脂质过氧化物分解产生的有害物质，能引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性[16]，因此MDA可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度[23]。数据显示，肝肾中MDA水平升高，意味着过氧化造成组织损伤及抗氧化剂的防御机制破坏[24]。呋喃染毒组较对照组，MDA水平明显增高（表2），柚皮苷的添加对肝肾的氧化损伤起到了保护作用。呋喃染毒造成了小鼠体内 GST、SOD和GSH活性，以及MPO、MDA和ROS含量明显变化，这与Cordelli等[23]研究一致。

细胞因子与细胞免疫反应、炎症反应、组织损伤或细胞修复有关，在细胞正常生理中起着重要的作用[25]。如表3所示，呋喃染毒激活免疫细胞，通过释放各种细胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10产生免疫应答。当小鼠灌胃柚皮苷后，血清中 TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6 水平显著下降，柚皮苷能通过抑制炎症反应从而减轻呋喃引起的组织损伤，其较强的抗氧化能力（表1）有助于抵抗呋喃所致小鼠的炎症反应。8-OHdG是氧化损伤的标志物[26]。呋喃染毒组与对照组相比较，16 mg/kg/d呋喃染毒7d后，8-OHdG的水平显著提高（P<0.05，图2），与Hickling等[27]研究一致。研究表明，柚皮苷可以明显减轻呋喃所致小鼠的DNA损伤，其中10 mg/kg/d柚皮苷有最好的保护作用。

肝脏是呋喃诱导大鼠和小鼠毒性作用的主要靶器官，具有明显的剂量依赖性[5]。ALT和AST是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，肝细胞损伤后，细胞膜的通透性增加，ALT、AST大量释放导致血清中ALT、AST指标升高[28-29]。ALT和AST的活性在一定程度上反映肝细胞坏死和损伤程度。目前将ALT、AST活性变化作为判定肝损伤程度的重要指标[30]。研究发现，呋喃引起了AST的活性和ALT的活性明显增加（表5），肝细胞严重损伤或者坏死，这与Moser等及Hamadeh等研究一致[31-32]。灌胃柚皮苷之后，小鼠血清中AST和ALT活性下降。同样，LDH也是细胞损伤的一个指标[33]，AST、ALT和LDH含量变化表明柚皮苷有效保护呋喃所致的肝损伤。BUN和Creatinine是佐证肾脏损伤最有效的方法之一[34]，因此可通过评价血清尿素氮和肌酐水平变化来研究呋喃所诱导小鼠的肾损伤，Gill等[35]发现呋喃可以显著提高血清中BUN和肌酐含量。柚皮苷治疗组（5，10，20 mg/kg/d）与呋喃染毒组相比较，柚皮苷能抑制BUN和肌酐水平的提高，有效阻止呋喃所致小鼠血清中BUN和肌酐含量增加，对肝肾损伤起到很好的保护作用。

4 结论

本研究首先提出了利用小鼠模型来研究食源性柚皮苷对呋喃所致小鼠肝肾损伤的保护作用。通过评估小鼠ROS含量，氧化损伤，细胞因子水平，DNA损伤，肝、肾损害，证实了食源性柚皮苷对呋喃毒性所致损伤具有保护作用。研究结果表明食源性柚皮苷对外源性有毒化合物（如呋喃）具有保护作用，但确切的保护机制有待进一步研究。通过研究食源性柚皮苷的抗氧化性和呋喃的毒性，为呋喃体内毒性防护提供可靠的理论依据，也为食源性柚皮苷在食品加工领域中的进一步应用奠定了基础。

更正说明

兹有发表在我刊2019年第19卷第8期第22-30页上的论文：《绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞增殖及免疫活性物质的影响》，因作者疏忽，第一作者的出生年份有误，现更正为“1981年”。

特此说明。

《中国食品学报》编辑部

2019年9月18日