海豹油精制及酯化过程中品质和挥发性物质变化规律的研究

郑振霄 戴志远 * 彭 茜 张蒙娜 沈 清

（1浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012

2浙江工商大学 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012

3大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连116034）

海豹（Phoca hispida）是一种生活在高寒地带的四脚哺乳动物。海豹油是从海豹脂肪组织中提取的常温下呈淡黄色液体的脂肪油，它是二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）等ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）的重要来源，富含多种对人体有利的功能因子[1-2]。近年来的研究表明，ω-3PUFA在促进大脑及神经系统的生长发育，降低心血管疾病的发生等方面起到特殊的功效，可增强人体免疫力，预防癌症的发生[3-4]。由于其地缘及相关法律限制的原因，海豹及其副产物起初只是少数特殊科学研究的对象。近年来，过度的保护导致其超量繁殖，并且海豹与鳕鱼的主要膳食中都包括毛鳞鱼，海豹的大量繁殖导致鳕鱼的膳食来源不断减少，进而导致鳕鱼资源的大量衰减。正是由于这样的原因，一些国家提出有计划捕杀海豹的计划，海豹及海豹油的相关研究逐渐进入人们的视野。

鱼油含ω-3多不饱和脂肪酸的同时也含有一定量的胆固醇，而海豹等海洋哺乳动物的油脂虽富含多不饱和脂肪酸、维生素E、角鲨烯，但不含胆固醇[5]。海豹油与鱼油的另一个不同点是：海豹油除提供的ω-3多不饱和脂肪酸除EPA、DHA外，还含有母乳的重要成分DPA（增效因子），其含量一般大于3%。而鱼油中除了EPA与DHA外，几乎不含DPA。许多研究证明，DPA在保持动脉血管壁柔软，抑制血管内皮生长因子（VEGF）引发的肿瘤，抑制血小板凝聚等方面具有独特功效[6-7]。用海豹油制成的ω-3 PUFA产品在预防和治疗心血管疾病、糖尿病方面比鱼油产品更有效[8]。

原油在提取过程中不可避免引入一些非油脂成分，如磷脂、色素及蛋白等。这些非油成分能够破坏油脂的稳定性，影响油的感官性状，同时也会妨碍后期的精炼及精深加工。对原油进行精炼，对保持油脂的品质及后续的精深加工都有重要意义。原油一般颜色较深，粘稠，并伴有浓重的腥臭味。对原油首先进行脱胶处理，以除去其中的胶溶性杂质，再经脱酸处理除去油脂中的游离脂肪酸，然后利用某些吸附能力强的表面活性物质去除油脂中的色素和杂质，最后经脱臭工艺去除油脂中的不良气味，得到精制油。毛油精炼后，品质大幅度上升。精制油中的ω-3 PUFA含量通常较低，不能够满足人们的需求，要对其中的ω-3多不饱和脂肪酸进行富集，才能作为保健品及药品的原料。然而，甘油三酯结构中的脂肪酸通常是具有异质性的[9]，并具有较高的沸点，这些性质决定直接用甘油三酯来富集是很困难的。通常将甘油酯乙酯化后再富集。甘油三酯乙酯化后，结构中只连接一种脂肪酸且沸点降低，更易分离。乙酯化的方法通常有酸催化法，碱催化法及酶催化法[10]，酸催化法作为一种操作简单、经济实惠的方法被广泛应用于油脂加工企业。

精制和乙酯化作为功能油脂生产不可或缺的工序，对产品的品质具有重要的影响。研究精制和酯化对海豹油品质及挥发性物质的影响，对于功能性油脂的生产意义重大。张建友等[11]研究了精制对鱼油品质的影响，发现精制可以显著降低鱼油的酸值和过氧化值，提高鱼油的碘值，而对鱼油中EPA和DHA的含量影响不大；刘书成等[12]研究了精炼工艺对金枪鱼油脂肪酸组成的影响，结果表明：精制可以提升鱼油的品质，而对其脂肪酸组成影响不大；张红燕等[13]研究了脱臭工艺对金枪鱼油品质及挥发性物质的影响，指出脱臭工艺可显著减少鱼油中挥发性物质的种类和数量，并且温度越高，效果越明显。虽然许多学者对油脂加工过程中品质的变化进行了研究，但以海豹油为对象，全面分析其在精制及酯化过程中的品质及挥发性物质变化规律还鲜见报道。本文以海豹油毛油为原料，研究精制及酯化过程中海豹油品质及脂肪酸组成的变化，通过GC-MS分析海豹油挥发性物质的变化，为功能性海豹油的生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海豹油毛油由舟山市奥旭鱼油有限公司提供；活性土购于黄山市白岳活性白土有限公司；37种脂肪酸混标购于上海安普科学仪器有限公司；其它试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂层萃取头，美国Supelco公司；7890B气相色谱仪，美国Agilent公司；Trace GC Ultra气相色谱与DSQⅡ质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 海豹油的精炼

海豹油的脱胶、脱酸、脱色及脱臭工艺参考张建友[11]的方法。

1.4 海豹油的乙酯化

海豹油的乙酯工艺如下[10]：海豹油→加入定量的无水乙醇→加入定量的浓硫酸→无水硫酸钠脱水→恒温反应→转移到分液漏斗→水洗至中性→静置分层→乙酯油

1.5 理化指标的测定

水分及挥发物：参照GB/T5528-2008动植物油脂水分及挥发物含量的测定方法测定；酸价：参照GB/T5530-2005动植物油脂酸价和酸度的测定方法来测定；皂化值：参照GB/T5534-2008动植物油脂皂化值的测定方法来测定；过氧化值：参照GB/T5538-2005动植物油脂过氧化值的测定方法测定；碘值：参照GB/T5532-2008动植物油脂碘值的测定方法来测定。

1.6 脂肪酸组成测定

海豹油甘油酯的甲酯化：称取100 mg脱色鱼油于具塞试管中，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOHCH3OH溶液，充分摇匀，65℃水浴加热30 min，取出后自然冷却，再加入2 mL 15%BF3-CH3OH溶液，充分摇匀，65℃水浴加热3 min，取出后自然冷却，然后加入2 mL正己烷提取，静止分层，取上层清液并加入少量无水Na2SO4，过有机相滤膜后用气相色谱仪进行脂肪酸相对含量测定[14-15]。

海豹油乙酯的甲酯化：取脂肪酸乙酯30～100 mg，于具塞试管中，加入2 mL 15%BF3-CH3OH溶液，充分摇匀，65℃水浴加热3 min，取出后自然冷却，然后加入2 mL正己烷提取，静置分层，取上层清液并加入少量无水Na2SO4，过有机相滤膜后用气相色谱仪进行脂肪酸相对含量测定[16]。

GC检测条件：HP-88氰丙基色谱柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；载气：H2；不分流进样；进样量1 μL；检测温度220℃；程序升温：起始柱温设定为70℃，以15℃/min升至 120℃，保持 1 min，再以5℃/min升至175℃，保持10 min；最后以5℃/min升至220℃，保持5 min。

1.7 挥发性物质的测定[17]

SPME：称取5 g样品置于15 mL顶空进样瓶中，60℃下平衡10 min，并将老化好的50/30μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂层萃取头插入进样瓶顶空部分，60℃下吸附30 min，取出后插入GC进样口，250℃解吸3 min。

GC条件：色谱柱为TR-35 MS（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦气；进样口温度 250℃，不分流进样；升温程序：初始温度40℃，保持3 min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持 7 min。

MS条件：离子源温度200℃；电子离子源（EI）；电子能量70 eV；传输线温度250℃；检测器温度280℃；质量扫描范围m/z 30～500。

1.8 数据处理

试验数据定性分析时，通过NIST 2.0谱库做自动检索确认定性，且仅当正反匹配度（SI/RSI）均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果才予以保留。定量分析时采用峰面积归一化法求得各挥发性成分相对百分含量。

相关测定数据以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 21.0统计软件包对各组数据进行显性分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 理化指标

海豹油原油、精制油及酯化油的理化指标如表1所示。原油中的水分及挥发性物质的含量为1.65%，显著高于精制油（0.49%）和酯化油（0.48%），而精制油和酯化油中的水分及挥发性物质的含量差异不显著。水分及挥发性物质主要包括油脂中的水分及一些沸点较低的物质，这些物质的存在对油的品质会产生不良影响。Cozzolinoa等[18]的研究表明油脂中的水分及挥发性物质会和温度、光照强度及增强剂等单独或协同作用加速油脂的酸败；孙丽琴等[19]的研究表明油脂中水分及挥发性物质的含量与油脂中的微生物及酶的活动相关，含量越高，油脂的品质越差。酸价是衡量油脂中游离脂肪酸（FFA）含量的指标。油脂中存在一定量的FFA，FFA的存在会使海豹油带有刺激性气味从而影响海豹油的整体质量，更重要的是FFA比甘油酯中的脂肪酸更容易发生氧化酸败，此外高含量的FFA会导致皂的形成，这对于此后甘油和酯的分离带来很大的困难[20-21]。原油、精制油及酯化油的酸价分别为 3.11 mg KOH/g、0.63 mg KOH/g和0.84 mg KOH/g，原油的酸价明显高于精制油和酯化油，精制油和酯化油的酸价远低于华盛顿营养委员会（CRN）规定的功能性油脂质量标准中的限定值（＜3 mg KOH/g），这说明精制可以显著降低海豹油的酸价，提升原油的品质。皂化值表示在规定条件下，中和并皂化1 g样品所消耗的氢氧化钾的毫克数，皂化值是反映油脂纯度及脂肪酸分子质量大小的重要指标[22]。从表1中可以看出原油的皂化值（165.69 mg KOH/g）低于精制油（181.48 mg KOH/g）和酯化油（177.73 mg KOH/g），而精制油和酯化油的皂化值没有显著差别，这说明精制可以显著降低海豹油的皂化值，减少原油中的不皂化杂质的含量，而乙酯化对海豹油皂化值的影响不显著。油脂过氧化物值是判断油脂及其制品氧化程度的重要指标，主要反映油脂中氢过氧化物的含量，是评价油脂品质的重要依据。从表1中可以看出，原油、精制油和酯化油的过氧化物值没有显著差别，这说明在处理过程中油脂发生氧化的程度较低，原因可能是整个反应过程是处于高度真空或者是充氮的条件下进行的，氧气含量很低，因此油脂发生氧化的程度不明显。碘值反映油脂不饱和程度，从表1可以看出，精制油（117.27 g I2/100g）和酯化油（116.63 g I2/100g）的碘值要明显高于原油（110.79 g I2/100g）。这说明在精制过程中，海豹油中的杂质不断被去除，使得海豹油的不饱和程度得到提高[10]。

2.2 脂肪酸组成

海产哺乳动物油脂的最大的特点就是富含单不饱和脂肪酸（MUFA）和ω-3 PUFA，饱和脂肪酸相对较少。海洋哺乳动物的脂肪酸组成与鱼类相似，但比例差距很大，海豹等海产哺乳动物油脂中的MUFA组成通常在40%以上，而鱼油中的MUFA通常在20%左右，此外海豹油中还含有鱼油中几乎没有的特殊脂肪酸-DPA。海豹油中常见的饱和脂肪酸有 C12∶0、C14∶0、C16∶0和C18∶0，通常可以检测到 少 量 C20：0，有时会检测到微量的C22∶0和C24∶0[23-26]。海豹油原油、精制油及酯化油的脂肪酸组成如表2所示。从表2中可以看出，原油，精制油及酯化油中均检测到了6种饱和脂肪酸，它们分别是 C12∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0和C20∶0。饱和脂肪酸中C16∶0含量最高，质量分数分别为9.37%，9.06%和13.41%，其次是 C14∶0，分别占到 4.71%，4.46%和6.49%。原油，精制油和酯化油中均检测到了6种MUFA，它们分别是 C14∶1，C16∶1，C17∶1，C18∶1trans，C18∶1cis和C20∶1，其中 C18∶1cis含 量最 高，分别 占 到25.75%，20.89%和19.28%，其次是 C16∶1，质量分数分别为18.17%，15.88%和14.66%。海豹油脂质富含ω-3 PUFA是动物低温适应的结果，因为在较低温度下，ω-3 PUFA仍能保持液体状态而不会结晶[27]。从表2中可以看出，海豹油中的ω-3 PUFA主要是EPA，DPA和DHA，EPA和DHA的含量较为接近，占到总脂肪酸的7%～8%，而DPA含量相对较低，占总脂肪酸的4%左右，这样的结果与加拿大学者Shahidi等[26]的报道具有一致性。

表1 海豹油原油、精制油及酯化油的品质指标Table 1 The characterization of the crude，refined and ethyl ester seal oil

海豹油原油、精制油及酯化油中饱和脂肪酸的含量分别为16.72%，16.06%和21.98%。原油和精制油中的饱和脂肪酸含量相差不大，但均低于酯化油中的含量，这说明酯化工艺可以促进饱和脂肪酸含量的上升。海豹油原油、精制油及酯化油中MUFA的含量分别为60.53%，58.56%和53.68%，呈逐渐下降的趋势。对比表2，C16∶1和C18∶1cis的下降最为明显，这说明精制和酯化工艺对这两种脂肪酸含量的影响最大；而对于C18∶1trans，趋势则相反，原油、精制油和酯化油中的含量分别为5.56%，9.18%和8.94%，这说明精制和酯化会导致其含量的上升。海豹油原油、精制油及酯化油中PUFA的含量分别为22.75%，25.38%和24.34%，相对于原油，精制油和酯化油中的PUFA含量略有上升，这可能是因为原油中的杂质经精制脱去后，海豹油中PUFA的质量分数得到提升的结果。海豹油原油、精制油及酯化油中EPA、DPA和DHA的总含量分别为19.48%，19.58%和19.36%，含量没有显著差别，说明精制及酯化处理对海豹油中的EPA、DPA和DHA的含量影响不显著。

反式脂肪酸与长期困扰人类的重大疾病如冠心病、心肌梗死等心血管疾病有着密切的联系。从表2中可以发现 C18∶1trans和C18∶2trans这两种反式脂肪酸的含量在整个过程都呈现上升趋势，其中C18∶2trans在原油中没有检测到，而出现在精制油及酯化油中，这样的结果表明，精制及酯化工艺会导致反式脂肪酸含量的上升。油脂在精制加工及酯化过程中，在强酸、强碱及长时间高温等条件的影响下，不饱和脂肪酸容易从顺式结构转化为能量上更为稳定的反式构象，使得反式脂肪酸含量增加。Henon等[28]的研究表明亚麻酸在脱臭阶段的异构化现象最为严重，张建友[11]也指出油脂在精制及酯化过程中，应控制高温作用的时间，进而控制产品中反式脂肪酸的含量。

2.3 挥发性物质

HS-SPME-GC-MS是测定挥发性物质的一种常用手段，既具有准确性高、选择性好、鉴别能力强的特点，同时又具有所需样品少、灵敏度高的特点[29]。许多学者都采取GC-MS的方法对油脂中的挥发性物质进行了研究。王亚男等[15]利用GC-MS对超临界萃取得到的金枪鱼油中的挥发性物质进行了研究，发现鱼油中的主要挥发性物质为酸类、醛类、烃类、酮类及一些杂环化合物。李文佳等[30]利用GC-MS对淡水鱼油中的挥发性物质进行了测定，分析结果表明醛类是淡水鱼油中的主要挥发性物质，占到总挥发性物质的45.26%。

表2 海豹油原油、精制油及酯化油的脂肪酸组成（%）Table 2 The fatty acids composition of the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

本试验采取HS-SPME-GC-MS的方法对海豹油原油、精制油及酯化油中的挥发性物质的种类和含量进行了测定，并以不同种类物质的峰数量和峰面积对海豹油中的挥发性物质进行分析。海豹油中挥发性物质的种类及数量如表3所示，海豹油原油、精制油及酯化油中分别测得86，50和44种挥发性物质，原油中含有的杂质较多，因此从原油中测得的挥发性物质也最多，精制油和酯化油中挥发性物质的种类数相差不大，这样的结果与本文第一部分中不同海豹油中的水分及挥发性物质的含量具有较高的一致性。原油中的烃类和醛类物质的种类数较多，其次是酯类和芳香族化合物，而酸类和酮类的种类数较少；精制后海豹油中的醛类物质的种类数减少最多（21降至4），其次是烃类（21 降至 14）和酯类（16 降至 8），这说明精制可以显著降低海豹油中的醛类物质的数量；酯化油中的酯类物质最多（24种），其次是烃类（11种），酯化油中的酯类物质明显增加，这说明酯化工艺导致了许多挥发性物质由酸或醇等其它的形式转化为酯。

表3 海豹油原油、精制油及酯化油挥发性物质的种类及数量Table 3 The classification and quantity of volatile substances in the crude，refined and ethyl ester seal oil

海豹油原油、精制油及酯化油挥发性物质的总峰面积分别为83.16%，60.06%和36.19%，这表明随着精制及酯化工艺的进行，海豹油中的挥发性物质的含量在不断减少。张红燕等[13]研究了精制工艺前后金枪鱼油中挥发性物质的变化，发现精制可以明显减少金枪鱼油中挥发性物质的种类和含量。不同种类物质的峰面积如图1所示。从图1中可以看出，原油中醛类物质贡献的峰面积最多，占33.48%，其次是烃类19.66%；精制油中最多的是烃类占16.93%，其次是酯类14.83%；酯化油中酯类物质的峰面积最多为27.00%，其次是烃类。对比可得，精制工艺对海豹油中的醛类物质影响最大，峰面积从33.48%减少到2.00%，这可能是由于醛类物质多数具有较低的沸点，脱臭环节的高温使多数醛类物质发生了转化；酯化工艺对海豹油中的烃类物质、酯类物质、及一些杂环含N化合物影响较大，峰面积分别从16.93%降至5.03%，14.83%增加到27.00%，4.75%减少到0.51%。海豹油原油、精制油及酯化油中的挥发性物质的名称及含量如表4所示。从表4中可以看出，原油中主要是2，4-庚二烯醛、壬醛、辛醛、己醛及庚醛等物质赋予海豹油原油以油脂气息、鱼腥味、泥土味、脂肪香味、青草香味、蜡香味等。精制油及酯化油中的挥发性物质含量及数量大大减少，只是少量烯醇类和酯类贡献的鱼腥味、油脂气息及蔬菜香味等。

图1 海豹油原油、精制油及酯化油中挥发性物质的相对含量（%）Fig.1 Relative content of volatile compounds in the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

表4 海豹油原油、精制油及酯化油中的挥发性物质种类及含量（%）Table 4 The classification and relative content of volatile substances in the crude，refined and ethyl ester seal oil（%）

（续表4）

（续表4）

（续表4）

3 结论

精制可以显著地（P<0.05）降低海豹油中的水分及挥发性物质的含量和酸价，分别由1.65%降低到 0.49%，3.11 mg KOH/g降低至 0.63 mg KOH/g，而乙酯化对其影响较小；精制可以显著提高海豹油的皂化值及碘值，分别从165.69 mg KOH/g 提高到 181.48 mg KOH/g，110.79 g I2/100g提高到117.27g I2/100 g，这说明在精制过程中，海豹油中的不皂化物等杂质不断被去除，使得海豹油的纯度得到提高；海豹油原油、精制油及酯化油中的过氧化物值分别为4.42，4.31和4.23 meq/kg，表明精制及酯化工艺过氧化物值的含量影响不显著。

海豹油原油、精制油及酯化油中的MUFA含量最高，分别占到60.53%，58.56%和53.68%，其次是PUFA，含量分别为22.75%，25.38%和24.34%，SFA含量最少为16.72%，16.06%和21.98%；对比可得，精制及酯化处理过程中MUFA含量呈下降趋势，而SFA含量总体有所上升；海豹油原油、精制油及酯化油中的EPA、DPA和DHA的总含量分别为19.48%，19.58%和19.36%，表明精制及酯化工艺对海豹油中的EPA、DPA和DHA的含量影响较小。

海豹油原油、精制油及酯化油中分别检测出了86，50和44种挥发性物质，挥发性物质的总峰面积分别为83.16%，60.06%和36.19%，这说明精制工艺可以显著降低对海豹油中的挥发性物质的种类和含量，而酯化工艺可以显著降低海豹油中挥发性物质的含量；海豹油原油中的主要挥发性物质为醛类（21种，33.48%），精制后的主要挥发性物质为烃类（14种，16.93%）和酯类（8种，14.83%），酯化油的主要挥发性物质为酯类（24种，27.00%），表明原油经过精制工艺，其中低沸点的醛类物质被降解，转化为酸类物质，而酸类物质在酯化阶段最终被转化为更为稳定的酯类。