一例牙鲆淋巴囊肿病例的诊断及病毒MCP 基因遗传进化分析

孟凡亮，曹龙龙，焦秋林，李 焱，王宏宇，刘照虎，马梓承，刘思当

（山东农业大学动物科技学院，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，山东泰安 271018）

淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）属于虹彩病毒科淋巴囊肿病毒属，是淋巴囊肿病的病原体，可引起全球140 种以上的鱼类患病。淋巴囊肿病（lymphocystis disease，LCD）在养殖的海水鱼和淡水鱼中均有发生，通常与养殖相关的应激条件有关，但在自由生活的鱼类中也有报道[1]。LCDV 感染可导致鱼皮肤、鳍和尾鳍上长有单个或聚集的菜花样肿瘤样结节[2]。有研究[3-4]证实：在鱼类心脏、脾脏等内脏器官和眼睛中也存在病毒感染；囊肿除发生在鱼体表外，在鳃、咽喉、肠壁、肠系膜、肝、脾、卵巢等器官上也可能出现，严重者可密布于全身。

LCDV 是 双 链DNA 病 毒， 目 前 已 获 知LCDV-1（欧洲株）和LCDV-C（中国株）全基因组序列，但二者基因组差异很大。基因组比较显示，两种LCDV 基因组在大小、组织和遗传同一性方面具有高度的多样性。此外，根据主要衣壳蛋白基因（MCP）序列，LCDV 至少可分为9 个基因型。MCP 基因是虹彩病毒科病毒系统发育研究的主要靶基因[5-6]。

LCDV作为危害鱼类养殖业的重要疫病病原，越来越受到人们的关注。本研究对山东省某牙鲆鱼场疑似LCDV 感染病例进行了综合诊断，对病毒MCP 基因进行了测序和遗传进化分析，以期为该病的综合诊断及流行病学调查以及病原的相关分子生物学研究和疫苗制备等提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2019 年1 月，山东省某牙鲆鱼场出现疑似LCD 病例。患病鱼体表出现菜花样瘤状物，死亡率超过30%。剖检病死鱼，并采集鱼体表的瘤状物及其脾脏、肾脏、肠等病料样品各两份。一份用10%的福尔马林溶液固定，经常规制作，石蜡切片、HE 染色，进行病理组织学检查；另一份冰冻保存，进行病毒DNA 提取与鉴定。

1.2 主要试剂

琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、pEASY-T1 simple cloning vector 及T1 感 受态细胞：购自北京全式金生物技术有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker：购自宝生物工程大连有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank 中登录的LCDV-1（L63545）、LCDV-C（AY380826）MCP 序列，分别设计2 对引物[7]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 病毒核酸提取与扩增

参照EasyPure Viral DNA/RNA Kit 说明书，对收集的病料研磨液进行核酸提取。以提取的核酸为模板，用两对LCDV 引物分别对模板进行PCR 扩增。扩增体系为25 μL，扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 病毒MCP 基因序列测定分析

将上述核酸提取物，用LCDV LCC 引物进行50 μL 体系扩增，将扩增后的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。将目的条带所在的凝胶部分分离，使用胶回收试剂盒，回收目的片段；将胶回收的目的片段连接pEASY-T1 simple cloning 载体，然后转入感受态细胞进行增菌培养。先用PCR 对菌液进行鉴定，将鉴定为LCDV-MCP 的阳性菌液送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序鉴定，并对测序结果进行遗传进化特点分析。

2 结果

2.1 眼观病变

经外观及剖检病变观察，发现病变主要表现为鱼体表长有灰白色、菜花样瘤状物，鱼鳃及鱼鳍上也有多个瘤状物（图1），而内脏器官未见明显的眼观病变。

图1 病鱼剖检病变

表2 参考毒株信息

2.2 病理组织学变化

鱼体表肿瘤样组织中，可见成纤维细胞增生、变圆、膨大和聚集，形成淋巴囊肿细胞，在胞浆内可见大量的包涵体（图2-A），肝细胞普遍发生空泡变性（图2-B），脾脏充血、出血（图2-C），鳃小片上皮细胞变性、坏死、脱落（图2-D），肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，间质出血（图2-E），肠绒毛黏膜上皮细胞坏死脱落（图2-F）。

图2 感染鱼的组织病理变化（HE，200×）

2.3 病毒PCR 鉴定

分别用设计的两对LCDV 引物进行PCR 扩增。扩增结果显示，以LCDV-C 毒株为参考序列设计的LCC引物扩增为阳性，说明该病例存在LCDV感染。

图3 MCP 基因扩增琼脂糖凝胶图

2.4 核苷酸和氨基酸序列分析

利用DNAstar 中的MegAlign，将本试验所得毒株（190103LCDVSD）和参考毒株的核苷酸和推导氨基酸进行同源性比较分析。通过分析可知，本试验所得毒株的核苷酸和推导氨基酸序列与参考毒株序列相比，与基因I 型LCDV-1 毒株的同源性最低，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.7%和86.8%；而与以LCDV-C 毒株为代表的基因II 型序列同源性较高，核苷酸和氨基酸序列同源性分别介于99.6%～99.9%和99.3%～100%。具体比对结果见表3、表4。

2.5 MCP 基因遗传演化分析

选取35 株不同基因型LCDV 的MCP 基因参考序列与本次序列，利用MEGA6 的Maximum-Likelihood 方法构建进化树。结果（图4）显示：根据MCP 基因分型，本试验所得毒株序列与LCDV-C、JF00Kuma、JF03Yoshi、JF03GunNeA、JF、LCDV-K1 等同属于基因II 型，且与我国牙鲆分离株LCDV-C 有较高的同源性，说明本试验所得毒株在牙鲆鱼中未发生较大变异。

表3 本试验毒株MCP 基因与不同基因型参考毒株同源性比对结果

表4 本试验毒株MCP 基因与基因II 型参考毒株同源性比对结果

3 讨论

我国重要的海水经济鱼类一般都对LCDV 易感，包括真鲷、大菱鲆、花鲈和牙鲆等[8]。LCD一年四季均可发病，其中水温在10～20 ℃时发病达到高峰[9]。研究发现，该病具有自愈现象，且受温度影响较大，当温度高于25 ℃时，病鱼体表瘤状物会自动掉落，鱼体逐渐恢复健康；但水温低于15 ℃时，未见自愈现象[10-11]。

虹彩病毒MCP 蛋白是其病毒粒子中表达丰度最高的蛋白，占整个病毒粒子多肽的40%～45%，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP 基因的同源性差异进行虹彩病毒分子进化方面的研究[12-13]。

图4 新分离株与参考毒株的遗传进化树

4 结论

病理学检查发现，该病例病变符合LCD 的病理学特征；分子生物学检测发现，所检测毒株与选定的LCDV 参考毒株核苷酸和氨基酸同源性均较高；MCP 基因遗传进化分析表明，所检测毒株属于基因II 型，与我国分离株LCDV-C 同源性较高，未发生较大变异。综合判定该病例为LCDV 感染。该研究为LCD 诊断及其流行病学调查提供了新资料，为下一步进行LCDV 相关分子生物学研究以及疫苗制备等提供了理论依据。