PCV2 感染后JAK-STAT 信号通路的基因差异表达分析

时建立，彭 喆，吴晓燕，，王 硕，孙盼盼，王 妍，李 俊

（1. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；2. 山东师范大学生命科学院，山东济南 250014；3. 青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

猪圆环病毒2 型（PCV2）可引起断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）等多种疾病[1]，是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。猪圆环病毒毒株一直在不断地变异，其中由PCV2 引发的疾病引起了研究人员更为广泛的关注，但到目前为止，其致病机制尚未被完全阐明。

信号通路在病毒感染细胞后的复制和致病力等方面发挥着重要作用。PCV2 感染后引发的细胞信号转导研究将有助于阐明PCV2 的致病机理。

TLR/MyD88/NF-κB、JNK/p38MAPK、PI3K/Akt

以及AMPK/ERK/TSC2/mTOR 等信号通路，在PCV2 感染过程中发挥着促进感染细胞凋亡、促进或增强病毒本身复制能力等作用[2-9]，基因描述见表1。JAK-STAT 途径是多数细胞因子的信号传导途径，在α-IFN 信号转导途径中发挥着重要作用。α-IFN 与细胞膜上α-IFN 受体结合，激活JAKSTAT 信号转导途径，控制包括免疫应答、细胞生长、细胞分化和血细胞生成等多种重要的生物学功能。截至目前，JAK-STAT 信号通路在PCV2 感染PK-15 细胞时的作用机制及其与病毒复制的相关性尚无报道。

本研究采用PCR 列阵方法，建立PK-15 细胞JAK-STAT 信号通路的功能分类芯片，通过分析JAK-STAT 信号通路中Jak 和Stat 家族成员、激活JAK-STAT 信号通路的受体、与Stat 蛋白相关的核辅助因子及共同活化因子、Stat 诱导蛋白及该通路的负反馈调节蛋白等基因在PCV2 感染前后的差异表达情况，为进一步研究JAK-STAT 信号通路在PCV2 感染时起作用的关键基因、影响PCV2 复制的分子机制、提高病毒滴度及宿主抗病毒免疫反应机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与仪器

PK-15 细胞PCR-Array 分类芯片、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量试剂盒：购自QIAGEN 公司；Roche480 II 荧光定量PCR 仪：购自德国罗氏公司。其他试剂均为进口或国产分析纯品。

1.2 病毒感染和RNA 提取

无PCV1 污染的PK-15 细胞培养于含有10%新生牛血清的DMEM 培养基（GIBCO）中，6 孔板长到80%时接种滴度为106.0TCID50/mL PCV2 SD 株（GenBank：DQ478947）1 mL，分别培养24、48、60 和72 h，弃上清液；采用QIAGEN 公司的RNA 提取试剂盒提取RNA，具体步骤按照说明书进行。

1.3 反转录和PCR-Array 反应

采 用QIAGEN 公 司 的RT2 First Strand 试 剂盒进行cDNA 合成，操作步骤按照说明书进行。PCR-Array 反应在96 孔板中进行，取反转录后的cDNA 102 μL，QIAGEN 公司2×RT2SYBR Green Mastermix 1 350 μL，再加入无RNase 的水至2 700 μL；将其加入96 孔板中，25 μL/孔，按照以下程序进行荧光定量反应：95 ℃ 10 min、95 ℃15 s、60 ℃ 1 min，并收集荧光信号，72 ℃ 15 s，40 个循环。采用QIAGEN 公司的线上数椐库进行统计分析。

1.4 相对定量PCR 验证

根据PCR-Array 统计结果，选择接种病毒后上调、下调明显的基因，应用荧光定量PCR 重新验证，以GAPDH 为内参基因，进行相对定量检测。选择基因及其引物设计如下：

应用以下程序进行荧光定量反应，扩增曲线：95 ℃ 30 s，循环1 次；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，循环40 次，72 ℃单点检测信号。溶解曲线：95 ℃ 0 s、65 ℃ 15 s、95 ℃ 0 s，连续检测信号。

表1 相对定量PCR 试验中的基因名称及引物序列

采用2-△△Ct 法，对数据进行相对定量分析。

2 结果与分析

2.1 PCR-Array 反应

通过QIAGEN 公司的线上数椐库，对PCRArray 的反应结果进行分析。结果显示：除去应用的6 个对照基因后，选择的90 个JAK-STAT信号通路相关基因，在PCV2 接种PK-15 细胞24 h 后，提取样品中有39 个基因为下调基因，16 个为上调基因；48 h 后，提取样品中有36 个基因为下调基因，21 个为上调基因；60 h 后，提取样品中有51 个基因为下调基因，9 个为上调基因；72 h 后，提取样品有53 个基因为下调基因，13 个为上调基因。此结果也进一步证明，细胞中JAK-STAT 信号通路对病毒感染后的调控是一个动态变化过程，不同时间点有不同的基因参与调控，而且不同时间点的部分基因表达有显著性差异，从而尽可能维持细胞平衡。基因差异表达情况如图1 所示。

图1 JAK-STAT 信号通路在不同时间点提取样品后的差异基因表达情况

2.2 相对定量PCR 检测

根据PCR-Array 检测结果，重新选取在4 个时间点都有明显差异表达的16 个基因合成引物，以GAPDH 为内参基因进行相对定量检测。结果显示：在选择的16 个基因中，和PK-15 细胞对照组相比，基因IL2RG、PIAS3、ISG15、SOCS3 和IL10RA 基因上调表达明显，与PK-15 细胞对照组差 异 显 著；B2M、IRF1、GRB2、LRG1 和GRB2基因的上调表达，与PK-15 细胞对照组相比差异 不 显 著；SMAD4、CEBPB、JAK2、STAT5A、INSR、JUN 和SRC 基因的下调表达，与PK-15 细胞对照组相比差异不显著，和PCR-Array 检测结果基本一致（图2）。

3 讨论

PCV2 1991 年在加拿大首次暴发，随后在世界许多国家和地区流行。目前我国大部分猪群中存在PCV2 感染，且常与多种病原混合感染，造成形式多样、病理复杂的临床症状，尤其是断乳仔猪，同时表现腹泻、呼吸困难、严重消瘦、贫血，偶尔伴有黄疸，随着共感染病原的不同，死亡率也有很大差异，给养猪业造成严重的经济损失[10]。

图2 荧光定量PCR 检测基因差异表达情况

细胞因子IL-2 不仅在免疫反应中发挥重要作用，而且能够促进细胞增殖。Teng 等[11]发现，PK-15 细胞转染IL-2 基因并稳定表达后，能够显著提高PCV2 的增值能力，在PCV2 增值中发挥着重要作用。本研究也发现，在PK-15 细胞接种PCV2 后，IL-2 受体基因（IL2RG）表达明显上调，IL-2 受体与IL-2 特异性结合后，可活化细胞内信号转导通路，从而发挥生物学效应。主要发挥作用的3 条信号通路转导通路为：JAK/STAT5 通路、P13K/Akt/mTOR 通路以及丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路。不同类型的细胞可以通过激活不同的分子进行信号转导，3 条通路既相互联系，又相互影响。本研究还发现，活化 Stat 的蛋白抑制物3（PIAS3）、干扰素刺激基因15（ISG15）等在PCV2 感染后也有明显的上调表达，提示其在病毒刺激机体产出先天性免疫反应方面发挥着重要作用。对于IL-2 及其受体基因在PCV2 感染PK-15细胞中的作用机制需要进一步研究。细胞信号转导抑制因子3（SOCS3）作为SOCS 家族的重要成员之一，是在细胞因子和生长相关因子信号转导通路中起负性调节的蛋白质因子。大量研究证明，SOCS3 基因可被多种炎症因子诱导表达，并且可抑制多种免疫分子的信号转导（图3）。最近的报道显示，SOCS3 基因的过表达能够抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡，并且降低AKT 磷酸化水平，说明SOCS3 基因能够抑制AKT 激活，从而调控细胞生长。Zhu 等[14]研究发现，PCV2 感染后，SOCS3 基因在没有临床症状仔猪的PBM 细胞中出现上调表达，在PK-15 细胞中也是上调表达，被小干扰RNA 抑制后，IL-6 和TNF-α 的表达量明显上调，因此SOCS3 基因可抑制原代免疫细胞的炎症反应，在PCV 2 亚临床感染中发挥重要作用。本研究也证实，PCV2 感染后SOCS3 基因出现上调表达，但对JAK/STAT 信号通路及其在PCV2 感染PK-15 细胞中的作用机制需要进一步研究。

图3 Jak-stat 信号通路发挥作用示意图

4 结论

本研究发现：PCV2 感染PK-15 细胞后，JAK-STAT 信号通路所有已知的Jak 和Stat 家族成员、激活JAK-STAT 信号通路的受体、与Stat 蛋白相关的核辅助因子及共同活化因子、Stat 诱导蛋白及该通路的负反馈调节蛋白等基因均发生差异表达；信号通路对病毒感染后的调控是一个动态变化过程，不同时间点有不同的基因参与调控，从而尽可能维持细胞平衡。