江苏省扬泰地区犬细小病毒分子流行病学调查

2019-10-12王海燕管远红徐亚亚曹明凤崔乐遥刘宗平

中国动物检疫 2019年10期

王海燕，谢静，王涛，刘静，管远红，张斌，徐亚亚，曹明凤，崔乐遥，刘宗平

（1. 江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2. 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）能导致犬和其他食肉动物发生急性出血性肠炎、白细胞减少症、幼犬致死性心肌炎以及恶心、呕吐等[1]。该病毒属于细小病毒科、细小病毒属[2]，与猫泛白细胞减少症病原（feline panleukopenia virus，FPV）密切相关。由于先发现的犬微小病毒（canine minute virus）已被称为CPV，为了与其区别就将该病毒命名为CPV-2。由于犬微小病毒多无致病性，已被列入牛犬病毒属，因此现CPV 多指犬细小病毒[2]。

CPV 是目前动物病毒中最小、最简单的一类线状单股DNA 病毒，全长约5 323 nt，无囊膜，直径约260 Å，二十面体对称。CPV 的完整核衣壳由60 个拷贝的VP1、VP2 和VP3 蛋白组装而成，其中包括5～6 拷贝的VP1 和VP3，以及53～54 拷贝的VP2，其中VP2 是CPV 核衣壳的主要构成蛋白，具有抗原性，可诱导机体产生抗体[3]。

发现该病后，疫苗很快就被应用到临床上，主要以最初的CPV-2 型作为疫苗株。随着使用时间的推移，疫苗的免疫效果出现了明显下降。研究发现，该病毒出现了抗原漂变，从而引发了对CPV 基因的研究[3]。CPV 变异速度很快，几乎与某些RNA 病毒相似，每个核苷酸每年出现约10-4的变异率[4]。CPV-2 型被确认后不久，1979—1981 年多个国家出现了CPV-2a 变异株[5]，1986年第2 个抗原变异型CPV-2b 被发现[6]，2001 年意大利报道了另一个新的变异型CPV-2c 亚型[7]。近期的一些研究表明，CPV-2c 型已经存在于很多国家，包括越南[8]、美国[9]、西班牙[10]、乌拉圭[11]和印度[12]，这就逐渐验证了CPV-2c 将在全球范围内流行的猜想[13-15]。另外我国也出现了CPV-2c的相关报道，表明目前在我国CPV-2c 型正与其他亚型共同流行[13]。CPV 由于核苷酸的突变形成了不同的基因型，而基因突变造成了抗原漂变，抗原漂变又引起了疫苗免疫效果的下降，甚至免疫失败。为了解江苏省扬泰地区的CPV 分子特征和基因型，通过病原分离和鉴定，开展了分子流行病学调查，以期为今后该病防控打下基础。

1 材料与方法

1.1 病料

2015 年10 月—2016 年12 月，在扬州和泰州地区宠物医院，对临床表现有血样腹泻、体温升高、呕吐和脱水等症状，经胶体金试纸条检测为阳性或弱阳性的病犬进行病例信息收集，并采集泄殖腔棉拭子或粪便作为检测样品，记录所采样品的流行病学资料，-20 ℃冷冻保存。标准参考株，来自扬州大学兽医学院传染病实验室。

1.2 试剂和培养基

10% DMEM（小牛血清）营养液、1%DMEM（小牛血清）维持液、无抗无血清DMEM、PBS 和1% PE（胰酶）：均按常规方法配制。Taq DNA 聚合酶、200 bp DNA Ladder Marker 等：购自Fermentas 有限公司；Biowest Agarose：购自上海美季生物技术有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS）：购自Sigma 公司。其他常规试剂，均为国产分析纯级产品。

1.3 实验仪器

台式高速离心机（TGL-16 型）：上海医用分析仪器厂产品；PCR 仪（Bio-Rad S1000 型）和BIO-RAD3000XI 型电泳仪：美国BIO-RAD 公司产品；UV-2000 紫外分析仪：天能科技（上海）有限公司产品；50 mL 细胞培养瓶：江苏江阴三宝玻璃细胞培养瓶厂产品；20 μL 及200 μL 移液器：法国Gilson 公司产品。

2 方法

2.1 样品预处理和病毒分离

将样品用含有双抗（青链霉素）的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）按照1:9 的比例稀释，并置于4 ℃过夜；接着8 000 r/min 离心10 min；取上清液，使用一次性微量过滤器（0.22 μm）过滤，然后接种于猫肾细胞系（FK81）并观察病变，盲传3代；将第3 代细胞毒，按照常规方法进行猪血血凝（hemagglutinin，HA）试验。

2.2 酚氯仿法抽提PCR 反应的DNA 模板

将疑似CPV 感染的样本分别接种FK81细胞，连传3 代，然后收获细胞培养液，用EasyPure®Viral DNA/RNA Kit 试剂盒抽提病毒DNA，-20 ℃冷冻保存备用。

2.3 PCR 扩增和序列分析

基因扩增引物参照文献[7]合成，序列见表1。将PCR 产物被送往上海生工生物技术有限公司进行测序，使用DNAstar 软件（Version 7.1.0）进行序列比对。

表1 CPV 基因分型引物

首先使用引物Pab 对样品进行分型，如果Pab扩增结果为阳性，再使用引物Pb 确定CPV-2b 亚型。如果Pb 扩增后的结果为阴性，就证实此样品毒株属于CPV-2a 亚型；如果结果为阳性，则属于CPV-2b 或2c 亚型，再根据测序突变与否，确定具体为何种亚型。

3 结果

3.1 病毒分离及HA 试验

样品接种约72 h 后，在FK81 细胞上形成典型的拉网状病变（图1-B）。接过毒的绝大多数细胞均发生肿胀、变圆以及脱落。共获得了48 个分离株。

HA 试验结果表明，盲传3 代后的病毒滴度在1:64～1:256 之间。

3.2 PCR 扩增

Pab 引物和Pb 引物PCR 扩增结果见图2、图3。根据PCR 结果可知，48 株病毒中，有4 株CPV-2、24 株CPV-2a（表2）。对剩余20 株进一步测序，以确定具体亚型。

3.3 427 bp 片段基因序列比对分析和基因型确定

经测序，发现剩余的20 株毒株均为CPV-2b型。核酸序列比对发现，该基因型在426 位（根据CPV-b，M38245 的核酸序列）没有出现G 到A的突变，也就是说在氨基酸残基426 位没有出现Asn/Asp426Glu 的突变，未发现CPV-2c 型突变株。最终确定的基因型见表3。

图2 样品Pab 引物PCR 扩增结果

4 讨论

图3 样品Pb 引物的PCR 扩增结果结果

表2 4 株CPV-2、24 株CPV-2a 分离株来源

表3 测序的20 株PCV 分离株来源与亚型

CPV 突变速率很高，与一些RNA 病毒一样，短期内可形成多种变异株[3-5]，造成临床上疫苗免疫失效。鉴于对家养犬类和一些野生食肉动物健康的潜在威胁，人们对该病毒的变异情况越来越重视[15]。在各个国家和地区中，CPV 不同变异株所占的比例不尽相同[8-12]。我国犬类中，该病毒感染率很高，各种基因型均有，但有一定的地域差别[13]。

本研究对扬州、泰州地区采集到疑似CPV 感染的48 份样品进行了毒株分离鉴定与分型，结果发现CPV-2a 和CPV-2b 亚型的比例高，这与报道的CPV-2a 占主导地位的报道有很大的不同[14]。引起这个不同的原因可能有两点：第一，在强大的选择压力之下，我国的CPV-2a 亚型变异株正在不断地向CPV-2b 亚型进化；第二，扬州、泰州地区的CPV 变异株分布与北京地区本身就存在非常大的差异。本研究将分离株序列与Genbank 上发表的序列比较后发现了一些氨基酸残基的非同义替换。这些替换对CPV 生物学特性的影响还有待进一步研究。尽管在这次的扬州、泰州地区CPV 分子流行病学调查中并未发现CPV-2c，但因采集样品有限，仍不能排除CPV-2c 在该地区的存在。

目前使用的大多数疫苗都是基于最原始的1979—1981 年分离的CPV-2 型病毒的弱毒苗[16]。该疫苗在控制CPV 传播流行方面起到了重要作用[17]。而最新抗原型弱毒疫苗，能产生更为全面的保护力[16]。Decaro 等[5]研究发现，CPV-2c 感染犬所表现的临床症状往往较轻，引起的动物死亡率也比CPV-2a/CPV-2b型要低的多。然而在本研究中，鉴定为CPV-2b阳性样品来源犬的症状也都比较轻，甚至与一些报道的CPV-2c 引起的症状相一致，推测这可能是因为使用的其他基因型疫苗也产生了一定的交叉保护。