新疆外地输入猪肉水饺的非洲猪瘟病毒检测

苏晓慧，任 娟，李 舵，马晓艳，美热木古丽•巴依待拉提，乌那尔汗•吉斯汗，王 文，薛 文，秦 菊，居马别克•夏拉巴依

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830063）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、烈性猪传染病，发病率、致死率可高达100%，危害严重，对养猪业可造成毁灭性打击，可引起巨大的经济损失和社会影响[1]。ASF自2018 年8 月在辽宁省首发以来，已在我国多个省份发生[2-3]。为进一步加强ASF 防控，新疆地区加强临床监视、现场排查，对生猪从生产到屠宰全程进行采样监测，严格控制生猪及其产品调运监管，多部门协调联动，形成了良好的工作机制。

2018 年12 月5 日，新疆巴州若羌县动物公路检查站在拦截的袋装水饺中采集样品13 个批次，经新疆动物卫生监督所实验室检测，发现5 个批次呈ASFV 核酸阳性。随后，将疑似阳性样品送中国动物卫生流行病学中心复核，确诊为ASFV 核酸阳性。为进一步了解新疆地区外地输入猪肉水饺的ASFV 污染情况，在该区其他公路检查站和冷库超市开展了ASFV 排查工作，又连续排查出4 个批次的外地输入速冻水饺为ASFV 核酸阳性。这是新疆地区自2018 年9 月开展ASF 专项排查以来，首次排查出输入性猪肉制品携带ASFV。

1 材料

1.1 样品

样品来源：动物公路检查站拦截的速冻猪肉馅水饺，其中来源于A 厂13 个批次、B 厂1 个批次；在冷库、超市中抽检B 厂速冻猪肉馅水饺11 个批次。样品的采集、保存和运输严格按照《非洲猪瘟监测样品采集、保存与运输方法》[4]中的要求，以猪肉产品的批次为采样单位，每批次按猪肉产品包装的规格（件/箱）随机抽样。数量为每批次随机抽取10 件（箱），每件（箱）采集样品2 份，合计每批次采集样品20 份。

1.2 试剂

天根磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒（批号S7327）、DNA 病毒反应液（批号20181129）：购自北京世纪元亨动物防疫技术公司；TaqMan 探针、ASFV 特异性引物、提取阳性对照、反应阳性对照：均由中国动物卫生流行病学中心提供。

1.3 仪器设备

上海博讯电热恒温水槽SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量组织研磨仪、Sigma3K-15台式冷冻高速离心机、天隆NP968 自动核酸提取仪、QuantStudio5 实时荧光定量PCR 仪。

2 方法

2.1 样品处理

每批次每袋随机挑取2～3 个饺子，挑出其中的猪肉进行剪碎。在加有陶珠的组织研磨管中，加入1 mL PBS 缓冲液，再加入剪碎的样品约100 mg，使用 Bertin Precellys 组织研磨仪进行匀浆处理。处理后放入60 ℃水浴锅灭活30 min，每间隔5 min 颠倒混匀样品1 次。

2.2 病毒DNA 提取

对灭活后的样品4 ℃ 2 000 r/min，离心10 min；取200 μL 上清液，使用磁珠法病毒DNA 提取试剂盒提取DNA；将提取的核酸于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 荧光定量PCR

采用ASFV 特异荧光定量PCR 方法扩增ASFV VP72 基因片段[4]。PCR 以20 μL 体系进行：DNA 病毒荧光反应液10 μL、ROX 0.2 μL、无菌无核酸水5.7 μL、正向引物0.8 μL、反向引物0.8 μL、TaqMan 探针0.5 μL，模板DNA 2 μL。同时，设立提取阳性/阴性对照、反应阳性/阴性对照。密封反应试管，瞬时离心，放入荧光PCR 仪，按照荧光PCR 循环条件扩增。

3 结果

根据ASFV 检测操作规程分析，样品Ct 值低于40 为阳性。12 月5 日检测的13 个批次样品中，有5 个批次检测到ASFV 特异性扩增曲线，Ct 值为28.3～32.68（图1），其他批次荧光定量PCR 检测结果见表2。

图1 12 月5 日荧光PCR 扩增结果

表2 猪肉馅水饺的荧光定量PCR 检测结果

4 讨论

4.1 阳性猪肉产品的处置

新疆畜牧兽医局接到中国动物卫生流行病学中心的复核确诊后立即行动，要求动物卫生监督部门会同食品药品监管部门按照应急预案开展处置工作，销毁阳性样品，并通知各级食品药品监管部门、畜牧兽医等部门，对同批次产品进行无害化处理，对相关场所进行彻底清洗消毒，同时继续加强开展ASF 疫情排查工作。

4.2 加强流调溯源

本次速冻猪肉水饺中ASFV 核酸的确诊在国内是首次，能从猪肉产品中检出ASFV，说明ASFV 已形成了一定污染面。此次在速冻猪肉水饺中检出ASFV 核酸，推断是由于潜伏期带毒猪没有临床症状，屠宰后进入加工企业，被加工生产成猪肉制品所造成的[5]。ASFV 自身较脆弱，对热抵抗力不强[6]。虽然此类猪肉制品一般直接进入餐桌，在蒸煮烹饪过程，均能将病毒杀死，但是水饺中猪肉的溯源应引起主管部门的高度重视，这也是控制疫病传播风险的重要环节。水饺在烹饪过程中，如果未对猪肉进行高温处理，未煮熟的水饺会以餐厨垃圾喂猪或进入养殖户，很容易造成ASFV 的传播扩散[7]。其次如果在加工处理车间，人员、车辆、污水、废弃物处理不当，就有可能造成病毒扩散，从而引发新的疫情[7]。因此，要加强产地检疫和屠宰场的实验室检测，及时发现发病猪和处于潜伏期的猪，防止问题猪肉流入食品生产环节。

4.3 继续做好ASF 防控

目前国内ASF 疫情仍呈点状散发态势，因猪肉制品调入而传播ASF 的风险较高，因此应该警惕通过污染病毒的猪肉制品而引发疫情的可能。鉴于目前ASF 防控形势仍较严峻，今后仍需重点排查养殖场、生猪交易市场、屠宰场等高风险场点，同时加大公路检查站对跨省入疆生猪和猪肉产品的检查和查处力度，严格控制从疫区调入生猪及相关产品。