竹叶花椒枝和叶精油化学成分及其对二磷酸腺苷诱导血小板聚集的影响研究

马 捷，李 梅*，宁莉萍*，王景燕,3，龚 伟,3，高 玥，丁 文，唐 诗

1四川农业大学林学院，成都611130；2四川旅游学院，成都610100；3四川农业大学生态林业工程省级重点实验室，成都611130

竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)为芸香科Rutaceae花椒属Zanthoxylum小乔木，耐寒，耐旱，不耐涝，适生于肥沃壤土和沙壤土。竹叶花椒果皮辛香，是东亚地区的传统烹饪调料和中药材原料。据《中华人民共和国药典》记载，其果皮及种子可温中止痛，杀虫止痒。因此，目前国内外学者的研究主要集中于花椒果皮的化学成分、提取工艺[1]、生物活性[2]、贮藏条件[3]、丰产栽培[4]等方面，鲜见枝叶研究。而在生产实践中，枝叶量大但不好回收利用。利用植物对环境胁迫的响应原理以及竹叶花椒优良的萌蘖能力，低海拔种植地区直接从二级分支处剪截大枝再采果，废弃枝叶占竹叶花椒当年营养生长物质总量的80%以上，如何进行整株综合利用有待研究。

精油为植物次生代谢产物，是具有一定气味的挥发性油状液体物质，在日用化工、医疗保健、害虫防治、食品工业等领域均有着广泛的用途[5]。花椒果精油具有抗菌[6]和抗氧化[7]特性，长期食用可缓解冠状动脉粥样硬化性心脏病[8]，但竹叶花椒枝和叶精油却未有相关报道。因此，本研究以竹叶花椒枝和叶为研究对象，通过水蒸气蒸馏法提取精油[9]，分析其化学成分和研究其抗二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)诱导的家兔血小板聚集活性[10]，以期为高效合理和高值化利用竹叶花椒废弃物资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

竹叶花椒枝和叶采自四川省崇州市四川农业大学教学实践基地，八月份采集。日本大耳白兔购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。主要试剂有ADP和二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司；替卡格雷(Ticagrelor)，上海冠东生物科技有限公司。主要仪器有B24-29型挥发油测定仪，东莞市创瑞工业试验设备有限公司；Agilent-HPGC7890型气相色谱仪，Agilent公司；MDSMS5975型质谱仪，Agilent公司；Chrono-log700型血小板聚集仪，Chrono-log公司。

1.2 精油提取

参考文献方法[9]，准确称取竹叶花椒新鲜枝600 g、叶600 g，粉碎处理。根据《中华人民共和国药典》挥发油测定法(甲法)，将粉料放入圆底烧瓶中，按固液比约1∶4加入蒸馏水，浸泡2小时后缓慢加热至沸腾，保持微沸5小时后停止加热，待装置冷却至室温，收集回流冷凝装置中的精油，用无水硫酸钠干燥后避光保存于4 ℃环境中。

1.3 Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)检测

正己烷以100∶1稀释样品。气相色谱条件：色谱柱HP-VOC 30 m×0.25 mm×0.25 μm。升温程序：初始温度40 ℃保持2 min，再以5 °C/min升至180 ℃保持2 min，后以5 °C/min升至240 ℃保持8 min；进样口温度250 ℃，进样量10 μL，载气为高纯度氦，流速1.0 mL/min。质谱条件：电离方式EI，电离能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，扫描范围35～550m/z。数据处理与质谱检索：通过对总离子流各质谱扫描后得质谱图，经软件检索NIST14.L谱库，结合比对保留时间及保留指数，查阅相关文献，最终确定精油化学组成，用峰面积归一法测算各成分的相对含量。

1.4 抗ADP诱导的家兔血小板聚集活性检测

参考文献方法[10]，精油样品加DMSO稀释，配制成100 mg/mL溶液备用。阳性对照Ticagrelor加 DMSO溶解，制成0.5 mg/mL溶液备用。日本大耳白兔经耳中央动脉抽取血液(枸橼酸钠真空抗凝采血管，全血∶枸橼酸钠为9∶1)，所得抗凝血离心(200×g,10 min)所得上清液为富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)；剩余血液继续离心(2 400×g,20 min)，所得上清液为贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)，以PPP调PRP血小板计数为500×109个/L。

抑制率(%)=(空白对照组最大聚集率-样品

组或阳性对照组最大聚集率)/空白对照组最大聚

集率× 100%

2 结果与讨论

2.1 精油提取量

竹叶花椒叶精油提取量为0.67 mL/kg，枝精油提取量为0.22 mL/kg，叶精油提取量是枝精油的3.05倍，叶精油提取量明显高于枝精油。目前国内外对竹叶花椒叶和枝精油的研究仅集中于精油成分及生物活性方面，其提取量还未有相关报道，因此本研究是首次报道竹叶花椒枝和叶精油的提取量。

2.2 精油的GC-MS分析

图1、图2分别为竹叶花椒枝和叶精油总离子流图。表1为竹叶花椒枝和叶精油主要化学成分。本文采用峰面积归一法计算化合物在精油中的相对含量，每个峰代表一个化合物，由图1、图2和表1比较可知，叶精油中芳樟醇的相对含量即占62.01%，所以峰明显，其他成分相对含量较低，因此与芳樟醇比峰不明显。枝精油多峰明显突出，是因为主要成分分布较分散。叶精油主要集中于10到30分钟区间出峰，而枝精油在30分钟到45分钟出峰密集，说明枝精油较叶精油含有更多熔沸点较高、分子量较大、分子结构更复杂的化合物。

图1 竹叶花椒枝精油总离子图Fig.1 The total ion chromatogram of essential oilsfrom branches of Zanthoxylum armatum DC.

图2 竹叶花椒叶精油总离子图Fig.2 The total ion chromatogram of essential oils from leaves of Zanthoxylum armatum DC.

枝精油鉴定出48种化学成分，占化合物总量的96.59%；叶精油鉴定出45种，占化合物总量的99.92%。枝精油主要化学成分有2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亚麻醇5.32%，芳樟醇5.21%。叶精油主要化学成分有芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-柠檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-对孟二烯2.27%。二者共同共有16种化学成分，分别占竹叶花椒枝精油和叶精油总含量的52.51%和87.6%。目前关于竹叶花椒叶精油成分的报道均来自印度学者。印度竹叶花椒叶精油主要成分为2-十一酮44.58%，芳樟醇14.53%，2-十三酮7.98%[11]。与本研究测得的中国竹叶花椒叶精油主要成分相似，都含有芳樟醇，2-十一酮，2-十三酮且含量明显高于其他化合物。但它们各自在总量中的相对含量具有较大差异，应该是受到了不同地理环境、气候和生境的影响。云南西双版纳产竹叶花椒枝精油主要成分为茴香烯20.5%，1,8-桉叶素14%，2-十三酮12.5%[12]，尽管与本研究中枝主要成分有一定差异，但都含有2-十三酮。竹叶花椒果精油主要成分为芳樟醇56.77%，D-柠檬烯18.97%，β-水芹烯11.98%[13]，其与竹叶花椒叶精油的主要成分相似度较枝精油高，这与叶的光合作用最为活跃，其次生代谢产生的大量化合物就近运输至果实有关。

竹叶花椒枝和叶精油开发前景十分广阔。竹叶花椒叶精油对大鼠爪水肿情况有显著的镇痛和抗炎作用[11]，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌的细胞活性[14]。其中主要化合物芳樟醇有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药理活性[15]；β-石竹烯有抗炎、抗癌、镇痛、神经保护和防治肝损伤等作用[16]；D-柠檬烯可防治糖脂代谢紊乱、抗炎、抑菌、抗癌[17]。此外，芳樟醇有铃兰香，β-石竹烯有柑橘香，D-柠檬烯有柠檬香，2-十三酮有奶香和药草样，2-十一酮有玫瑰香、奶酪香以及椰香，均为生产中常用的食用香精和香料。因此竹叶花椒枝和叶可作为开发优质香料、食用香精及医药保健品的原料选择。在预防心脑血管疾病方面，芹菜籽油能显著抑制ADP诱导的兔血小板聚集[18]，而芹菜籽油中的典型活性成分D-柠檬烯、芳樟醇、β-石竹烯竹[19]与竹叶花枝和叶精油相同，因此下文将对竹叶花椒枝和叶精油对ADP诱导的兔血小板聚集的影响进行研究，以期为竹叶花椒枝和叶的高值化利用提供参考。

2.3 抗ADP诱导的家兔血小板聚集活性测定

城市化生活导致高脂血症、动脉粥样硬化、高血压等心脑血管疾病患者骤增的同时，亦使这一群体对此类医疗保健的需求上涨。由于治疗心脑血管疾病的药物普遍价格较高，多数非洲和亚洲发展中国家的慢性病患者正转向国家卫生部推荐的植物类药物作为替代治疗来源。已有研究表明花椒果精油可减轻冠状动脉狭窄程度，为心脑血管疾病患病的保护因素[8]。竹叶花椒果精油主要成分为芳樟醇，D-柠檬烯，β-水芹烯，β-石竹烯，而竹叶花椒枝和叶精油均含有大量的芳樟醇、D-柠檬和β-石竹烯。相似的成分可能导致相似的生物活性。竹叶花椒枝和叶作为废弃物，量大且几乎零成本，目前采用的焚烧还田的做法不仅浪费碳汇资源而且污染环境。如果能从竹叶花椒枝和叶中提取出对心脑血管疾病具有疗效的成分，不仅可以高效利用废弃资源，而且有可能显著降低此类药物的成本。

表1 竹叶花椒枝和叶精油主要化学成分

续表2(Continued Tab.2)

峰号No.保留时间tR(min)化合物Compound含量Content(%)枝Branch叶Leaf3925.882-十七醇2-Heptadecanol0.504026.88榄香素Elemicin0.124127.23橙花叔醇2 Nerolidol 20.290.934227.72桉油烯醇Spathulenol0.200.144327.86氧化石竹烯Caryophyllene oxide1.930.364428.5(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-四甲基-12-氧杂环[9.1.0]十二烷-3,7-二烯(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-Tetramethyl-12-oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene0.534528.67癸氢-3,3,4,7a-四甲基-1H-环戊烷[a]戊-7-醇乙酸酯Decahydro-3,3,4,7a-tetramethyl-1H-cyclopenta[a]pentalen-7-ol acetate0.144629.52α-毕橙茄醇α-Cadinol0.504729.52绿花白千层醇Himbacco0.234830月桂酸乙烯酯Vinyllaurate0.134930.362-十五酮2-Pentadecanone0.225030.79正十五碳醛Pentadecanal0.625130.7911-乙酸十二烯酯11-Dodecenyl acetate0.215232.949-十六碳烯醛9-Hexadecenal0.215333.5十六醛Hexadecanal0.965434.084-硝基苯基月桂酸酯4-Nitrophenyllaurate2.665535.12环十六烷Cyclohexadecane0.215635.5213-十八碳烯醛13-Octadecenal0.375737.039-十八烯醇9-Octadecen-1-ol0.205837.1813-异海松二烯13-Isopimaradiene4.545937.659,17-十八碳二烯醛9,17-Octadecadienal4.120.146037.78亚麻酸Linolenic acid3.866137.87 2,13-十八烷二烯-1-醇2,13-Octadecadien-1-ol0.166237.979-十八烯醛9-Octadecenal11.576338.34十八醛Octadecanal0.636439.03亚麻醇Linoleic alcohol5.326539.18油醇9-Octadecen-1-ol1.820.186639.58(7Z,10Z,13Z)-7,10,13-十六碳三烯醛 (7Z,10Z,13Z)-7,10,13-Hexadecatrienal0.216739.691-十八烯1-Octadecene2.026840.18叶绿醇Phytol3.980.606940.59角鲨烯Supraene1.767040.761-甲基环癸烯 1-Methyl-cyclodecene,0.507141.002,4-十二碳二烯酰基异丁酰胺2,4-Dodecadienoyl isobutylamide1.437241.409-十八烯酰2-[(Z)-9-Octadecenyloxy〛ethanol0.437341.56亚麻酸乙酯Ethyl linolenate0.587442.712,6,10,14-十六烷-1-醇,3,7,11,15-四甲基2,6,10,14- Hexadecatetraen-1-ol,3,7,11,15-tetramethyl1.707544.50环戊烷-1,3-二甲酸甲酯Dimethylester-1,3-cyclopentanedicarboxylicacid0.727644.84油酸酰胺Oleamide0.267747.64二十烷Eicosane0.23总计Total(%)96.5999.92共同共有成分合计Total common components(%)52.5187.60

血小板是凝血机制的重要成分，不仅构成血小板-纤维蛋白栓子(Platelet-fibrin thrombi)，同时参与动脉粥样硬化斑的形成，因此抑制血小板聚集是治疗多种心脑血管疾病的重要手段之一。表2为竹叶花椒枝和叶精油对ADP诱导家兔血小板聚集的影响。由表可知1 mg/mL浓度下，竹叶花椒枝和叶精油对血小板聚集均有一定的抑制作用，叶精油抑制率为67.4%±24.0%，枝精油抑制率为14.3%±14.6%，叶精油的抑制率约是枝精油的4.7倍，因此叶精油的抑制效果显著优于枝精油。叶精油与空白对照相比P< 0.01，差异显著；枝精油与空白对照相比P> 0.05，差异不显著；阳性对照Ticagrelor与空白对照相比P< 0.001，差异非常显著。上述结果显示竹叶花椒叶精油抗血小板聚集效果稍弱于Ticagrelor，此系精油作为天然混合物，其中的有效物质含量明显低于成熟的纯品药物所致。与常规抗凝药物Ticagrelor的高成本、高价格以及可导致心脏停搏、痛风和肾脏损害等多种严重副作用相比[20]，竹叶花椒叶优势明显。其属于废弃物，量大且几乎零成本，精油成分主要为芳樟醇，2-十一酮，2-十三酮，D-柠檬烯等食品香精原料，毒性低，因此其开发为天然低成本心血管系统疾病药物以及保健日化产品的巨大潜力值得关注。

表2 竹叶花椒枝和叶精油对ADP诱导家兔血小板聚集的影响

注：与空白对照比较，**P< 0.01；***P< 0.001.

Note:Compared with the control,**P< 0.01;***P< 0.001.

3 结论

竹叶花椒叶精油提取量为0.67 mL/kg，枝精油提取量为0.22 mL/kg，叶精油提取量高于枝精油。

竹叶花椒枝精油鉴定出48种化学成分，占化合物总量的96.59%，主要化学成分为2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亚麻醇5.32%，芳樟醇5.21%；叶精油鉴定出45种化学成分，占化合物总量的99.92%，主要化学成分为芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-柠檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-对孟二烯2.27%。竹叶花椒枝和叶精油共同共有16种化学成分，分别占总含量的52.51%和87.6%。由于竹叶花椒枝和叶精油主要化学成分相似度较高，加之原材料易得，成本低廉，生产实践中可考虑混合提取，作为开发优质香料、食用香精及医药保健品的原料选择。

竹叶花椒枝精油对ADP诱导的家兔血小板聚集的抑制率为14.3%±14.6%，叶精油的抑制率为67.4%±24%，叶精油抑制效果显著优于枝精油。竹叶花椒叶有开发为天然低成本心血管系统疾病药物或相关产品的潜力。