不同产地女贞子化学质量特征分析

祝侠丽，张迪文，谢彩侠*，雷敬卫

1河南中医药大学药学院，郑州 450046；2 河南省中医研究院中药研究所，郑州 450006

女贞子为木犀科女贞属植物女贞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果实，具有滋补肝肾，明目乌发的疗效[1]，是一味传统的扶正固本药物。女贞子喜光耐荫，主要分布在我国广东、浙江、湖南、湖北、四川、河南等暖湿润气候地区，研究发现，不同产地的女贞子有效成分的含量差异较大[2]，而在女贞子临床用药过程中，并未对女贞子的产地做明确规定及要求，2015年版《中国药典》也仅仅用特女贞苷作为女贞子质量评价的主要指标，不能真实反映和区分不同产地女贞子质量的差异，影响了女贞子质量评价的准确性及临床用药的合理性。

中药材功效的产生是其内在多种化学成分相互协同产生的，单纯的指标性成分并不能真实反映与其功效相一致的药效物质，而HPLC指纹图谱提供的化学质量信息丰富，可以相对全面的表征中药的整体化学质量特征，目前已广泛应用于中药材的产地鉴别及质量控制中[3,4]。本研究基于HPLC指纹图谱的优点及女贞子药材在生产中存在的问题，收集全国主要产区的女贞子药材，对其中的女贞苷、特女贞苷及红景天苷的含量进行测定，并分析比较其HPLC指纹图谱特征，为不同产地女贞子质量特征的确定、女贞子质量控制标准的完善及女贞子药材质量可追溯系统的构建提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695自动高效液相色谱仪(配有Waters2998检测器)；Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(北京迪马科技有限公司)；CPA225D十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；ME54E型万分之一分析天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)；TY-500型超声波清洗仪(北京天佑恒达科技有限公司)；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；SZFJ-300型多用药材粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)；DZEW-5型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇和乙腈(色谱纯，Tedia Company)；甲醇和乙醇(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；娃哈哈纯净水；蒸馏水(自制)；特女贞苷、女贞苷、红景天苷对照品(批号分别为MUST-14040402、MUST-14062606、MUST-14071814，纯度均≥98%，成都曼思特生物科技有限公司。)

1.3 样品来源

收集河南、湖南、四川、浙江4个产区不同产地的女贞子饮片24批(见表1)。将女贞子饮片粉碎过40目筛，放于干燥器中保存备用。

表1 不同产地女贞子样品信息

2 内容与结果

2.1 不同产地女贞子中特女贞苷、女贞苷及红景天苷含量测定

特女贞苷的含量测定参考2015版《中国药典》中女贞子含量测定项下的方法。女贞苷及红景天苷的含量测定均按照文献[5]中所建立的方法进行测定，每个样品重复三次，取其平均值。三种成分对照品和女贞子样品的高效液相色谱图分别见图1、图2、图3。不同产地女贞子特女贞苷、女贞苷及红景天苷的含量测定结果见图4。

由图4知，不同产地女贞子中特女贞苷含量最高，女贞苷含量次之，红景天苷含量最低，三种成分的含量受产地的影响较大，女贞苷、特女贞苷和红景天苷在女贞子药材中含量的波动范围分别为0.92%～3.12%、3.96%～7.45%和0.05%～0.15%，而且四个产地之间表现的特征不同。其中，河南产地三个产区的特女贞苷及红景天苷含量相对稳定，而女贞苷含量有一定差异；湖南产地三个产区之间女贞苷含量差异相对较小，特女贞苷及红景天苷含量差异较大；四川产地不同产区之间女贞子中红景天苷含量较为稳定，其他两个指标变化较大；浙江产地两个产区三个指标的含量均有明显差异。另外，四个产地中湖南产地女贞子中女贞苷的含量整体较高，河南和四川两个产地的含量比较接近，单因素方差分析表明，四个产地之间无显著性差异；四川和河南两个产地女贞子中特女贞苷含量整体较高，但四个产地之间无显著性差异；四川产地女贞子中红景天苷含量较高，与其他三个产地的女贞子之间存在显著性差异(P<0.05)。

图1 女贞子中特女贞苷HPLC色谱图(A：对照品；B：样品)Fig.1 HPLC of the specnuezhenide of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

图2 女贞子中女贞苷HPLC色谱图(A：对照品；B：样品)Fig.2 HPLC of the ligustroflavone of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

图3 女贞子中红景天苷HPLC色谱图(A：对照品；B：样品)Fig.3 HPLC of the salidroside of Ligustri Lucidi Fructus(A:control;B:sample)

图4 不同产地女贞子中三种成分的含量 (A：河南；B：湖南；C:四川；D：浙江)Fig.4 The content of specnuezhenide,ligustroflavone and salidroside of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A:Henan;B:Hunan;C:Sichuan;D:Zhejiang)

2.2 女贞子HPLC指纹图谱方法的建立

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取女贞苷、特女贞苷、红景天苷对照品适量，分别加甲醇制成浓度为0.113、0.145、0.183 mg/mL的女贞苷、特女贞苷和红景天苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称定女贞子粉末约0.4 g，置具塞锥形瓶中，精密量取稀乙醇25 mL，称定重量，加热回流1h，放冷，称重，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤后即得供试品溶液。

2.2.3 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(0～25 min：10%乙腈→25%乙腈)；25～50 min：25%乙腈)；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；检测波长：275 nm。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行测定，对照品及供试品溶液的高效液相色谱图见图5。

图5 对照品(A)和女贞子样品(B)HPLC指纹图谱(a：红景天苷；b：女贞苷；c：特女贞苷)Fig.5 HPLC fingerprints of control(A)and Ligustri Lucidi Fructus(a:salidroside;b:ligustroflavone;c:specnuezhenide)

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

精密称取S-XF13号女贞子粉末，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.2.3”项下的色谱条件进样，连续进样6次，记录色谱图中共有峰的保留时间和峰面积，以共有峰12号峰作为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明相对保留时间的RSD值在0.00%～0.31%之间，相对峰面积的RSD值在0.00%～1.32%之间，符合指纹图谱的要求。

2.2.4.2 重复性试验

精密称取H-ZM2号样品6份，按照精密度试验的方法获取6份供试品溶液的指纹图谱，并计算其主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明相对保留时间的RSD值在0.00%～ 0.40%之间，相对峰面积的RSD值在0.00%～2.21%之间，符合指纹图谱的要求。

2.2.4.3 稳定性试验

精密称取H-ZZ5号样品粉末，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后测定其相应指纹图谱，并计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明相对保留时间的RSD值在0.00%～ 0.31%之间，相对峰面积的RSD值在0.00%～2.17%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 不同产地女贞子HPLC指纹图谱特征分析

2.3.1 不同产地女贞子HPLC指纹图谱共有模式的生成

分别从河南、湖南、四川、浙江4个省份中各选取4批代表性的女贞子样品粉末，按照2.2项下的方法获取16批女贞子样品的HPLC指纹图谱(见图6)。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行数据分析，设S1为参照图谱，设定时间窗宽度为0.3，采用中位数法，通过自动匹配及多点校正生成指纹图谱的共有模式(见图7)，共标定14个共有峰。结果显示，不同产地女贞子HPLC指纹图谱色谱峰的数目基本相同，说明不同产地女贞子的化学成分种类基本一致，但其中2号峰、红景天苷、4号峰、6号峰、女贞苷及14号峰等的峰面积差异较大。

图6 16批女贞子HPLC指纹图谱叠加图Fig.6 Vertical overlap of HPLC fingerprints for 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus

图7 女贞子饮片HPLC指纹图谱共有模式(3：红景天苷 11：女贞苷 12：特女贞苷)Fig.7 HPLC fingerprint common pattern of Ligustri Lucidi Fructus(3:salidroside;11:ligustroflavone;12:specnuezhenide)

2.3.2 不同产地女贞子指纹图谱相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，以生成的女贞子指纹图谱的共有模式为标准，其相似度为1.000，对不同产地女贞子HPLC指纹图谱进行相似度计算，并对各样品图谱间的相似度进行评价(见表3)。

表3 不同产地女贞子HPLC指纹图谱相似度

由表可知，不同产地女贞子指纹图谱的相似度差异较大，河南及浙江女贞子与女贞子的共有模式相比，指纹图谱的相似度均在0.9以上，说明这两个产地的女贞子质量基本可以代表女贞子的质量特征；湖南与四川产地的女贞子相似度较低，而且四川不同样品之间差异较大，说明这两个产地的女贞子除了具有所有女贞子质量特征的共性外，还表现出明显的地域性特征，这可能与湖南、四川的气候环境有一定关系。

2.3.3 不同产地女贞子HPLC指纹图谱的主成分分析和聚类分析

为筛选引起不同产地女贞子质量差异的特征成分，比较不同产地女贞子样品之间化学质量的相似性，为不同产地女贞子质量特征的确定提供科学依据，本研究进一步对指纹图谱进行了主成分分析和聚类分析。

2.3.3.1 主成分分析

将不同产地女贞子HPLC指纹图谱共有模式中共有峰的相对峰面积及保留时间分别作为原始信息数据导入SPSS 19.0软件进行主成分分析。设特征值1为提取标准，选择合适的主成分数，使方差贡献率累计值达到78%～ 90%，以保证提取的信息基本涵盖原样品的特征，以准确反映不同产地16批样品之间的质量表达差异性。经过对四个产地16批女贞子样品HPLC指纹图谱主成分分析得到各主成分的特征值(见表4)、主成分数的碎石图(图6)及各主成分所代表的共有峰的矩阵(见表5)。

主成分的贡献率反映了该成分所代表的色谱峰对原变量的解释度。不同产地女贞子HPLC指纹图谱主成分分析中的主成分特征值及碎石图分析结果表明，前5个主成分方差贡献率综合达到78.007%，它们基本反映了16批样品指纹图谱中的大部分信息。主要因子载荷矩表结果显示第1主成分主要反映了色谱峰4、6、9、14的信息，其中6号峰的载荷最高；第2主成分主要反映了色谱峰8、女贞苷的信息，其中女贞苷的载荷最高。第3主成分主要反映了色谱峰1、红景天苷、13的信息，其中红景天苷的载荷最高；第4主成分主要反映了色谱峰2、8的信息，其中8号峰的载荷最高。因此，除特女贞苷外，6号色谱峰所代表的成分、女贞苷、红景天苷及8号色谱峰所代表的成分可能是引起不同产地女贞子质量特征差异的主要指标。

表4 主成分特征值

2.3.3.2聚类分析

分别将四个产地16批女贞子指纹图谱共有峰的相对保留时间及峰面积导入SPSS 19.0软件对其进行聚类分析，选择组间连接为聚类分析的方法，平方欧式距离为距离的测量公式，绘制聚类分析的树状图(见图7)(s1 ～ s4为河南女贞子样品；s5 ～ s8为湖南女贞子样品；s9 ～ s12为四川女贞子样品；s13 ～ s16为浙江女贞子样品)。由聚类分析结果知，不同产地的女贞子样品质量特征相互交叉，无明显规律性，而且相同产地的女贞子样品也并没有聚为一类。

表5 主要因子载荷矩阵表

图8 碎石图Fig.8 Scree plot

图9 不同产地女贞子HPLC指纹图谱聚类分析Fig.9 The systematic cluster analysis of HPLC fingerprint of Ligustri Lucidi Fructus from different areas

3 讨论

中药材生长过程中产生的次生代谢产物是中药材产生临床功效的物质基础，也是评价中药材质量优劣的重要指标。次生代谢产物含量的高低受药材品种[6,7]、产区环境[8]、栽培方式[9]、采收时期[10]、加工方式[11]等多种因素的影响，而且不同种类的次生代谢产物，决定其合成与积累的关键生态因子及人文因子不同。本研究结果表明，由于女贞子在我国分布较为广泛，不同产地生态环境及栽培管理措施差异较大，导致了女贞子中女贞苷、特女贞苷及红景天苷的含量及不同产区三种成分的表现特征均具有一定的差异，其中红景天苷含量受产地的影响较大，表明了中药材质量的形成主要是种质与环境共同作用的结果。

道地药材是在特定地域与特定生长环境，并通过特定的生产加工过程生产的，较其他产地的同种药材质量好、品质佳、疗效好的，具有较高知名度与认可的中药材，具有明显的地域性。一般情况下，分布较为广泛的药材对生长环境的要求相对较低，地域性不明显，因此药材的产地质量特征可能并不明显，而中药材是一种多组分通过多靶点产生临床功效的特殊药品，单纯的几个化学成分并不能真实反映与其临床功效相一致的质量特征，HPLC 指纹图谱则可以较为全面的评价药材的整体化学质量，相对真实的反映其临床功效。本研究以女贞子中女贞苷、特女贞苷及红景天苷等环烯醚萜苷和苯乙醇苷类成分为指标建立了四个产地不同来源的16批女贞子样品HPLC指纹图谱来表征女贞子的化学质量，同时利用相似度分析、主成分分析和聚类方法分析不同产地女贞子的质量特征差异。相似度分析表明不同产地女贞子在化学成分种类一致的情况下，其差异主要体现在某些化学成分含量的高低上，其中河南、浙江两产地的女贞子药材质量特征比较接近，而湖南、四川两产地的女贞子与河南、浙江的差异较大，但聚类分析结果表明四个产地的女贞子药材质量特征相互交叉，并没有表现出区别于其他产地的明显特征。这与相似度分析的结果不太一致，因此在评价不同产地药材化学质量特征时，应尽可能同时采用多种分析方法，以真实反映不同产地药材的质量差异。

特女贞苷是女贞子中含量较高的一种环烯醚萜苷类成分，具有明显的药理作用，因此，2015 年版《中国药典》以特女贞苷含量作为控制女贞子质量的指标具有一定的合理性。主成分分析表明，女贞苷和红景天苷在内的10个色谱共有峰均不同程度的参与了不同产地女贞子质量差异的表达，而女贞苷和红景天苷均具有与女贞子滋补肝肾功效相一致的药理活性[12]，但2015版《中国药典》并没有将其作为评价女贞子质量的指标性成分。因此为了科学全面的反映不同产地女贞子质量，女贞子的质量标准还有待于进一步研究与完善。