垂盆草乙醇提取物诱导HEK 293T细胞凋亡及作用机制

彭勇波，王齐, 梁大焱

(中南民族大学 生命科学学院,医学生物研究所,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

垂盆草(SedumsarmentosumBunge)为景天科草本植物，在我国南北大部分地区均有广泛分布，在湖北省武陵山区垂盆草资源十分丰富.垂盆草性凉、味甘、可全草入药，常用于痈肿疮疡、小便不顺及急、慢性肝炎的治疗[1].对垂盆草药理活性成分及其药效的研究表明，垂盆草富垂盆草苷及苜蓿素、木犀草素、槲皮素等黄酮类的药理活性成分，能广泛参与肝炎细胞的保护作用[2-4]，它还有诸如抗癌、抗氧化、免疫抑制等药理活性[5，6].最近有研究报道指出垂盆草提取物能通过P53[7], STAT3[8]及NF-κΒ等信号途径抑制癌细胞的增殖并诱导细胞的凋亡[9].然而，对垂盆草活性成分对细胞增殖抑制和凋亡诱导作用还主要集中在对肝癌细胞的研究上，其是否对其他细胞具有同样作用，目前尚不清楚.本研究以HEK293T为研究对象，探讨了垂盆草乙醇提取物(EESS)对其增殖抑制和凋亡诱导的作用和机制，为进一步资源化利用垂盆草用于肿瘤等疾病治疗提供理论和实验依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HEK293T细胞(ATCC)；FBS(Sciencell)；RPMI 1640(Gibco)；乙醇(国药集团化学试剂)；Annexin-V FITC Kit(武汉安特捷生物)；兔抗鼠β-actin, Cyc, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, p-ERK, p-NF-κΒ 等一抗及羊抗兔IGg-HRP二抗(美国Cell signal technology).旋转蒸发仪(RE-3000, 上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(DZ-1A II, 上海精密仪器)；中草药粉碎仪(FW177, 天津市泰斯特仪器)，流式细胞仪(FACSCalibur II, 美国Becton Dickinson).

1.2 EESS的制备及储备液的配制

称取垂盆草全草500.0 g粉碎后，用70%乙醇按物料比1∶7浸泡2～3 d，取上清抽滤并合并滤液，旋转蒸发获得提取物.将提取物于真空干燥箱干燥至恒重，再用DMSO溶解成500 mg/mL储液，于4 ℃备用，用前用PBS稀释成1 mg/mL待用.

1.3 CCK-8检测细胞增殖数的变化

HEK293T细胞按2×103个/孔细胞密度接种于96孔培养板，培养24 h后换成含终浓度为10, 50, 100 μg/mL EESS的培养液100 μL，设正常对照组(不含EESS)，每组8个复孔，重复5次，培养48 h后每孔加入CCK-8染料10 μL，以空白孔调零，在酶标仪上检测450 nm处的吸光度A，按照细胞增殖抑制率/%= (1-A实验组/A正常组)×100，计算细胞抑制率.

1.4 Hoechst33342 染色法观察细胞凋亡

将洁净盖玻片置于6孔板内，接种细胞培养过夜，当细胞密度达到约70%时，每组分别加入10, 50, 100 μg/mL的 EESS，24 h后去除培养液，用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗1～2次，每次2 min，加入50 μg/mL Hoechst33342 染色液，摇床避光染色15 min，弃除染色液，用PBS 洗涤细胞2次，每次3 min，吸尽液体，滴加抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光显微镜上观察统计细胞荧光及形态.

1.5 Annexin V-FITC /PI 双染法检测细胞凋亡

按2×105个/孔细胞密度接种细胞于6孔板，培养24 h后，分别按终浓度10, 50, 100 μg/mL添加EESS到处于对数生长期的HEK293T细胞中，设正常对照(不含添加药物)，每组5个复孔，培养24 h后，收集细胞于10 mL离心管中，孵育缓冲液洗涤细胞1～2次后，1000 r/min 离心5 min，弃上清，并按照Annxin V-FITC Kit试剂盒说明书，利用流式细胞仪进行细胞凋亡检测分析.

1.6 蛋白质免疫印迹

收集对照组和添加不同浓度垂盆草乙醇提取物处理的细胞，10000 r/min离心5 min，去除上清，并用RAPI强裂解液(含PMSF，终浓度为1 mmol/L)冰上裂解细胞40～50 min，BCA法测定总蛋白的浓度.提取的总蛋白95 ℃变性5 min，SDS-PAGE并电泳后，依据蛋白marker大小切取含目的蛋白胶进行湿法转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗涤，一抗浓度(1∶1000)孵育过夜，TBST洗涤，二抗(1∶10000)孵育90 min，TBST洗涤，TBS洗涤，显影.

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 EESS对HEK293T细胞增殖的抑制作用

用EESS分别处理HEK293T细胞48 h后，CCK-8实验结果见图1.图1显示：0,10, 50, 100 μg/mL的EESS能显著抑制HEK293T细胞数量的增加，与正常细胞相比，有显著性差异(P<0.01或P<0.05)；其抑制效应随着药物浓度的增加而逐渐增强(P<0.01，r=0.914)，说明EESS对HEK293T细胞具有增殖抑制作用，且具有剂量依赖性.

与对照组相比, *表示P<0.05, **表示P<0.01

2.2 EESS对细胞凋亡的诱导作用

Hoechst33342染色检测EESS对细胞凋亡的诱导作用，结果见图2.由图2可见：用含不同浓度的EESS培养基培养细胞24 h后，均可诱导HEK293T细胞产生凋亡小体(图中白色箭头所示)，与对照组(未添加EESS)比较，具有显著性差异(P<0.01).10, 50, 100 μg/mL EESS产生的凋亡小体数量呈剂量依赖性增加(P<0.001，r=0.946).

注：白色箭头所示为凋亡小体，与对照组相比, **表示P<0.01

为明确添加EESS对HEK293T细胞增殖的抑制是通过诱导细胞的凋亡增加所致，利用流式细胞分析技术检测了不同浓度EESS处理HEK293T细胞后，其对细胞凋亡率的影响，结果见图3和表1.由图表可见：与对照组(未添加EESS)相比，10, 50, 100 μg/mL EESS均能显著地诱导细胞早期凋亡(P<0.05或P<0.01)和晚期凋亡(P<0.05)，且呈显著性剂量依赖性(早期凋亡：P<0.001，r=0.943；晚期凋亡：P<0.01，r=0.820).

a)对照；b～d)EESS 10,50,100 μg/mL

表1 EESS对HEK293T不同阶段凋亡的影响

2.3 EESS通过影响NF-κΒ, Cyc, Bax等凋亡相关信号分子促进HEK293T细胞凋亡

由于10，50 μg/mL EESS 对细胞凋亡的诱导作用不明显(诱导率均低于20%)，而100 μg/mL EESS对细胞凋亡的诱导率达到30%，故选择100 μg/mL EESS对HEK293T细胞凋亡相关的信号分子进行了Western blot分析，其通过NF-κΒ, Cyc, Bax等HEK293T细胞凋亡的影响结果见图4.由图4可见：100 μg/mL EESS能显著上调通过NF-κΒ的磷酸化水平、凋亡启动信号分子Cyc、促凋亡信号分子Bax的表达(P<0.05)；而对NF-κΒ信号通路上游分子ERK、抑制凋亡信号分子Bcl-2、Bcl-xL的表达无显著性影响(P>0.05).

注：与对照组相比,*表示P<0.05

3 讨论

垂盆草作为一种重要的药用植物资源，主要含有垂盆草苷类、黄酮类、三萜类、甾醇、生物碱及糖类，具有清热解毒、利尿消肿的作用，常被用于治疗咽喉肿痛、水火烫伤、肝纤维化[10].近年研究表明：垂盆草提取物能通过显著降低人肝癌细胞HepG2中STAT-3的表达，显著诱导细胞凋亡[11]，陆红等[12]研究表明低剂量盆草提取物能改善马兜铃酸致大鼠肾小管上皮细胞损伤，但高剂量能诱导肾小管上皮细胞的凋亡.为阐明垂盆草提取物对细胞凋亡影响和作用机制，本研究采用垂盆草乙醇提取物干预HEK293T细胞，结果显示其能通过诱导细胞凋亡明显抑制细胞增殖，并显著上调磷酸化NFκΒ-p65[13]的表达及凋亡启动因子Cyt c和凋亡促进因子Bax的表达.

核因子κB(NF-κB)与细胞凋亡密切相关，抑制NF-κB的活化可明显阻止疾病中细胞凋亡的发生，激活NF-κB通路能通过调控凋亡起始信号蛋白Cyt c的表达及凋亡因子蛋白Bcl-2/Bax的比例调控细胞凋亡.100 μg/mL垂盆草提取物能显著提高NF-κB-p65的磷酸化水平，并活化NF-κB信号通路.同时，起始和促进细胞凋亡的信号分子Cyt c和Bax的表达也显著上调，而抗凋亡蛋白信号分子Bcl-2, Bcl-xL等的表达则未见显著上调.因此，垂盆草乙醇提取物对HEK293T细胞的凋亡促进作用可能与NF-κB通路活化及凋亡起始蛋白和促凋亡蛋白的表达上调有关.

综上所述，垂盆草提取物能显著诱导HEK293T细胞的凋亡，并呈现一定的剂量依赖性.在诱导HEK293T细胞凋亡过程中，通过显著上调NF-κΒ-p65磷酸化水平、凋亡启动蛋白Cyt c和凋亡促进信号分子Bax的表达，诱导HEK293T细胞的凋亡.