土著细菌胞外聚合物对浅层地下水系统中砷增强的生物指示

魏小凡，谢作明，王 晶，高 班，孙家正，罗 艳

(1.中国地质大学(武汉)环境学院，湖北 武汉 430074；2.湖北省监利环境保护局环境监测站，湖北 监利 433300)

高砷(As)地下水已在多个国家和地区被发现[1]。砷的代谢微生物广泛参与砷的生物地球化学循环[2]，在高砷地下水的形成中扮演着重要角色[3]。砷对微生物具有较强的毒性，砷酸盐由于和磷酸盐具有相似结构，使细菌表现出“磷酸盐饥饿”症状，而对微生物产生毒性[4]。As(III)比As(V)毒性更强，可直接使蛋白酶失活[5]。由于长期暴露在高砷环境中，微生物进化出了耐砷基因，从而可以忍受高砷胁迫而适应高砷环境[6]。Oremland等[3]揭示了基于细菌还原砷酸盐或氧化亚砷酸盐的DNA系统的进化多样性，随着研究的深入，更多的砷代谢机制被发现[7]。

细菌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)附着在细菌表面或围绕在细菌周围，主要包含多糖和蛋白质，还有少量核酸、腐殖质和糖醛酸等物质。细菌EPS是决定微生物表面性质的关键物质[8]，在环境胁迫下，微生物会分泌更多的EPS[9]，而EPS围绕在细胞表面形成屏障，避免金属离子进入微生物胞内，以降低重金属的毒害作用[10]。细菌EPS中含有很多带负电荷的基团如羟基、氨基、羧基和酰胺基等[11]，可以通过表面络合、静电吸附[8]和离子交换[12]等吸附环境中的Cu、Zn、Pb、As等金属或类金属。林青华等[13]研究认为As(III)可以与细菌EPS中蛋白质Ⅱ的多类位点结合，并且这个反应是一个自发的放热过程，同时细菌EPS可能也参与了砷的还原过程；Babechuk等[14]利用Shewanellasp.ANA-3研究时发现细菌EPS上聚集有砷的还原产物。其他变价金属Ag、U、Cr在细菌EPS的作用下也会发生氧化还原反应，如Marshall等[15]研究发现，在厌氧条件下ShewanellaoneidensisMR-1分泌的细菌EPS具有结合和还原U的能力；Vigneshwaran等[16]研究发现，细菌EPS中的蛋白质能将Ag+还原成Ag纳米颗粒；此外，Batool等[17]研究也发现，在Cr(VI)的刺激下，微生物产生的细菌EPS包含一些Cr(VI)的还原酶，能将Cr(VI)还原为Cr(III)。

基于上述研究，本文以大同盆地高砷含水层沉积物中土著细菌D51001-1为生物材料，通过对该土著细菌进行不同形态砷胁迫培养，分析了厌氧条件下土著细菌D51001-1受As(V)和As(III)胁迫时的生长特征，以及细菌培养液中生物量、砷形态和细菌EPS组分的变化，并研究砷胁迫下土著细菌的防御机制和土著细菌对砷增强的响应机制，为地下水中砷的生物修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

试验所用土著细菌菌株为D51001-1(以下简称细菌)，由中国地质大学(武汉)环境学院谢作明课题组从大同盆地高砷含水层沉积物中筛选得到。

据研究，山西大同盆地高砷地下水区属于富有机质还原水化学环境，pH值偏弱碱性，其变化范围为7.5～8.6；无机砷以As(III)和As(V)两种形态存在，并且主要以砷酸盐为主，砷含量的变化范围为0.6～1 820 μg/ L，部分地区超过2 000 μg/ L[18]。

1.2 培养基的配制

LB培养基对细菌进行扩大培养，其配方为：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

无机盐培养基模拟大同盆地高砷地下水环境，具体成分如下：KH2PO40.14 g/L，KCl 0.50 g/L，CaCl20.13 g/L，NaCl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.62 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，60%乳酸钠5.4 mL/L，酵母提取物 1.00 g/L。少量酵母提取物提供微量元素，调节pH值至8.0左右，121℃高温蒸汽灭菌30 min。

1.3 砷胁迫下土著细菌D51001-1的生长

将土著细菌D51001-1在LB培养基中培养至对数期，为消除有机培养基中有机质对细菌ESP的影响，用0.9%NaCl溶液洗涤细菌使其重新悬浮于去离子水中制成细菌重悬液(OD600值为0.939)。

在两组250 mL无菌的无机盐培养基中分别添加As(V)和As(III)，最终浓度均为2 000 μg/L，设为试验组，另设一组不添加As作为对照组，其他条件与试验组保持一致，每组试验分别设3个平行。在厌氧操作箱中接种细菌重悬液，接种量均为2%；摇匀加盖后用密封带密封，置于30 ℃恒温培养箱中连续培养；在厌氧培养箱中每隔24 h取样一次，并用紫外分光光度计于600 nm处测定OD600值，并绘制细菌生长曲线。

砷含量的测定采用原子荧光光度法(AFS-930，北京吉天仪器有限公司)[19]。菌液先经0.22 μm滤膜过滤得上清液，上清液过离子交换柱分离得到As(III)和As(V)，因仪器检测范围限制，需对分离后的砷溶液进行稀释，保证其浓度低于50 μg/L；然后取1 mL含As(V)溶液，加入1 mL 50%盐酸和2 mL硫抗(硫脲+抗坏血酸)预还原并定容至10 mL，并与等体积的As(III)溶液样品一起上机检测，仪器自动测定砷溶液标准曲线，其R值达到0.999以上；最后根据砷溶液标准曲线计算稀释后的砷浓度，其结果乘以稀释倍数即得上清液中As(V)和As(III)的浓度。

1.4 土著细菌D51001-1分泌EPS的提取和测定

试验采用改进的EDTA法[20]提取细菌培养液中EPS。首先向菌悬液添加等体积2%的EDTA溶液，在25℃和300 r/min条件下摇床振荡提取3 h，再以12 000 r/min转速离心15 min，上清液用0.22 μm 醋酸纤维素滤膜过滤，滤液即为细菌EPS粗提液；然后将细菌EPS粗提液用3 000 Da透析袋透析去除杂质，室温下用去离子水透析48 h，得到提纯细菌EPS；最后将提纯的细菌EPS定容，测定其中蛋白质、多糖和核酸的质量分数。蛋白质质量分数采用Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准物质[21]；多糖采用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为标准物质[22]；核酸采用二苯胺比色法测定，以小牛胸腺DNA为标准物质[23]。

1.5 土著细菌D51001-1细胞的傅里叶红外光谱(FTIR)分析

分别取上述处理组和对照组细菌对数生长期的菌悬液，以5 000 r/min转速离心10 min，收集细菌细胞，真空冷冻干燥，得细菌细胞样品，采用KBr压片法对细菌细胞样品利用傅里叶转换红外光谱分析仪(Nicolet iS50，美国赛默飞世尔科技有限公司)进行扫描分析，扫描波长范围为400～4 000 cm-1。

1.6 数据处理

本次试验所得数据主要用Excel和Origin 8.0软件进行分析与处理。

2 结果与讨论

2.1 砷胁迫下土著细菌D51001-1的生长

光密度(OD)通常用作指示细菌的生长[24]，图1为不同砷形态下土著细菌D51001-1的生长曲线。

图1 不同砷形态下土著细菌D51001-1的生长曲线

由图1可见，细菌D51001-1在As(V)和As(III)的胁迫下均可以生长，但是存在生长差异；不同处理组下细菌均在第1 d达到最大生物量，随后逐渐下降；细菌培养1 d后，As(V)处理组和对照组的OD600值分别为0.156和0.154，几乎相同，而As(III)处理组的OD600值只有0.124，相比对照组降低了21%，说明细菌对As(V)胁迫具有较强的适应能力，As(V)对生物体的毒性也低于As(III)[3]，因此前期细菌生长几乎不受影响；而As(III)由于抑制了细菌的生物合成途径[25]，能够显著抑制细菌的生长，所以溶液中细菌的生物量低；随着培养时间的延长，As(V)处理组的细菌生物量下降速率大于对照组，5 d后的OD600值比对照组降低了17%，可能是因为As(V)的毒性影响了细菌的生长与繁殖。

2.2 土著细菌D51001-1对砷形态转化的影响

图2为土著细菌D51001-1培养液中砷含量的变化。

图2 土著细菌D51001-1培养液中砷含量的变化

由图2可见，As(V)处理组溶液中As(V)含量由2 000 μg/L减少到794 μg/L，同时溶液中As(III)含量增加到1 058 μg/L，大量As(III)的产生表明土著细菌D51001-1具有还原As(V)的能力，这是由于耐砷菌株中的砷抗性系统，如磷酸盐特异性转运系统[26]和ars操纵子[27]可以将细菌细胞中的砷排出胞外，从而减少砷富集对细菌细胞的伤害[28]；每个As(V)和As(III)处理组溶液中所测得的总砷含量均低于初始总砷含量，表明有较小一部分砷被细菌吸附；在第1 d内，As(V)处理组溶液中As(V)含量快速下降，而As(III)含量急剧增加，表明细菌对As(V)的还原效率最高，可能是因为第1 d内细菌的活性最强，因而表现出最高的砷还原能力；随着溶液中As(III)含量增加，砷的毒性增强，加之溶液中营养物质减少，细菌的活性减弱，细菌对As(V)的还原速度减缓；而As(III) 处理组几乎未检测出As(V)，说明该细菌对As(III)没有氧化还原能力。

2.3 砷胁迫对土著细菌D51001-1分泌EPS的影响

细菌分泌的EPS含量采用蛋白、多糖和核酸含量的加和，图3为As(V)和As(III)胁迫下土著细菌D51001-1的EPS分泌量。

图3 As(V)和As(III)胁迫下土著细菌D51001-1的EPS分泌量

由图3可见，各处理组和对照组的细菌EPS均在1 d内快速积累，和细菌生长保持一致；对照组中细菌EPS增加是细菌正常积累导致，到了后期细菌生物量有所下降，溶液中细菌EPS的积累速度变慢；不同处理组细菌分泌的EPS积累量差异显著，表现为As(III)处理组>As(V)处理组>对照组。这是由于细菌对砷胁迫的应激反应表现为细菌的EPS分泌量增加，以减少有毒物质对细胞的不良影响[9]，而细菌增加EPS分泌量的方式可能是其应对砷胁迫的自我保护机制，所以在毒性更强的As(III)胁迫下，细菌增加EPS的分泌量。Saltikov等[29]也认为细菌可以通过分泌EPS降低亚砷酸盐对细菌群落的毒害作用。可见，土著细菌D51001-1可以还原As(V)到毒性更强的As(III)，是导致As(V)处理组中细菌EPS含量增加的另一个原因。

图4为砷胁迫对土著细菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影响。

图4 砷胁迫对土著细菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影响

由图4(a)可见，培养期内各试验组中细菌胞外蛋白的分泌量依次为As(III)处理组>As(V)处理组>对照组，表明细菌胞外蛋白的分泌随砷毒性的增强而增多。这是由于蛋白中含有疏水性基团[30]，蛋白含量的增加一方面可以增强细胞间的亲和力，促进细菌团聚体的形成，从而避免溶液中砷对单个细胞的毒害；另一方面细菌细胞中的部分蛋白(如金属硫蛋白类蛋白)对As、Cd、Hg等重金属或类金属有一定的抗性[31-32]，因此蛋白的增加可以增强细菌的抗砷能力。由图4(b)可见，各试验组中细菌胞外多糖的分泌趋势与胞外蛋白相同，即随着砷毒性的增强，细菌分泌的胞外多糖含量逐渐增多。这是由于细菌可通过增加胞外多糖的分泌量加厚细胞外的胞外多糖层，抵御砷离子的胁迫，从而抵抗As(III)的侵害[33]。除蛋白和多糖的分泌以外，胞外环境中核酸含量的多少也可以指示细菌细胞的受损程度，核酸含量越高表明细菌细胞受损越严重。由图4(c)可见，As(V)处理组中细菌的核酸含量比As(III)处理组低，说明As(III)导致细菌细胞受损更严重，不添加砷的溶液中检测出的核酸含量增加是由于细胞的自然死亡导致的。图4(d)反映了溶液中多糖与蛋白的含量比值(即多糖/蛋白)，对照组中蛋白与多糖含量相差较小，而处理组中蛋白含量明显超过多糖含量，且As(III)处理组中细菌胞外多糖与蛋白含量的比值小于As(V)处理组。这是由于多糖与蛋白含量的比值反映了细菌表面正负电荷中和的结果[34]，随着砷胁迫的增强，细菌分泌的蛋白含量远远超过多糖含量，导致细菌表面正电荷增强，从而减少对砷的吸附。

2.4 土著细菌D51001-1细胞的傅里叶红外光谱(FTIR)分析

图5为砷胁迫下土著细菌D51001-1细胞的傅里叶红外光谱(FTIR)谱图。

图5 砷胁迫下土著细菌D51001-1细胞的傅立叶红外光谱(FTIR)谱图

由图5可以看出：

(2) 与对照组相比，经过砷处理的细菌细胞谱图中部分吸收峰发生了偏移，表明经过砷胁迫后细胞表面的部分官能团发生了相应变化。其中，在3 433 cm-1位置的吸收峰偏移到3 431 cm-1和3 432 cm-1处，这说明As(V)和As(III)与—OH结合在一起；在1 637 cm-1位置的吸收峰偏移到了1 639 cm-1和1 638 cm-1处，表明酰胺基与As(V)和As(III)结合后发生的伸缩振动变化；在900 cm-1位置的吸收峰偏移到了876 cm-1处，说明细菌表面物质中的苯环被取代，可能是紧密结合在细菌表面的EPS吸附了As(III)所致。土著细菌D51001-1细胞FTIR谱图中的吸收峰偏移和峰值强度变化证实了该细菌表面具有的官能团对砷具有一定的吸附作用。

3 结 论

浅层高砷地下水环境中，土著细菌D51001-1通过在生理生化特性方面作出相应调整以便适应在砷胁迫环境中生存。本文通过室内微宇宙模拟研究表明：浅层地下水系统中土著细菌D51001-1将As(V)还原为As(III)，增强了砷的毒性，为了应对砷毒性增强而导致的环境胁迫加剧，土著细菌通过增加EPS的分泌，并提高细菌EPS中蛋白和多糖的比例，同时利用细菌表面具有的多种官能团如羟基、羧基、酰胺基等增强对砷的结合能力，从而降低地下水环境中砷对细菌细胞的伤害。因此，可以利用土著细菌这些特征性的变化来指示浅层地下水系统中的砷异常。