PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在宫颈癌治疗中的研究进展

徐 苗，张天一，田菲菲

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，调查显示其发病率逐年攀升且发病年龄趋于年轻化，其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中排位第2，仅次于卵巢癌。大量研究表明高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)持续感染与宫颈局部微环境免疫水平低下是宫颈癌发生发展的重要因素[1]。目前，已研制出二价、四价、九价HPV疫苗用于预防宫颈癌，九价HPV疫苗可针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58九种亚型，但依然不能预防所有高危HPV类型[2]。而且疫苗作用有效，仅仅能够起到预防作用，对于已经感染HPV病毒的患者则疗效甚微。针对宫颈癌患者，传统疗法有较大的副作用，比如广泛性全子宫切除术以及放疗化疗等，并且晚期宫颈癌患者的预后不良。因此，寻找能够有效预防和治疗宫颈癌的方法非常重要。程序性死亡受体1(programmeddeath1，PD-1)和程序性死亡配体1(PD-1ligand，PD-L1)是一对免疫抑制性共刺激分子，在肿瘤发生发展过程中具有重要意义[3]，多种恶性肿瘤如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌等癌症中均大量表达PD-L1分子，该分子通过与肿瘤浸润T淋巴细胞表面的PD-1受体结合，抑制T细胞的分化和增殖，诱导T细胞失活或凋亡，从而使肿瘤细胞逃避宿主的抗肿瘤免疫[4]。PD-1/PD-L1信号通路抑制剂以高亲和力与PD-1或PD-L1结合，阻断PD-1与其配体PD-L1的结合来提高机体的抗肿瘤免疫能力。近年来，通过激活免疫系统来抗癌的免疫疗法逐渐成为了科学家们的研究热点，PD-1/PD-L1信号通路抑制剂作为免疫检查点抑制剂中的重要组成部分，已被美国FDA正式批准用于非小细胞肺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、胃癌、膀胱癌等癌症，并取得了良好的效果。在此背景下，亦有多篇研究报道指出PD-1/PD-L1信号通路与宫颈癌发生发展关系密切，本文对PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在宫颈癌治疗中的研究进行综述。

1 PD-1/PD-L1的分子结构与功能

程序性死亡受体1(PD-1)属于CD28/CTLA-4受体亚家族，由日本免疫学家本庶佑于1992年在发生程序性死亡的细胞株中发现[5]。PD-1是一个约55kD的I型跨膜糖蛋白，其结构特点是胞外区含有一个可变区结构，胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基[6]。PD-1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞[7]。PD-1的配体为PD-L1(B7H1)和PD-L2(B7H2)，属于B7家族成员。其结构与PD-1相似，含有可变区和恒定区结构。PD-L1广泛表达于多种恶性肿瘤细胞、淋巴组织和实体器官。

我们查阅了蛋白质数据库(ProteinDataBank，PDB)中PD-1/PD-L1复合物的晶体结构(登录号3BIK)，发现PD-1/PD-L1的分子识别主要由疏水及氢键作用介导。观察晶体结构发现，PD-1与PD-L1二聚体之间形成了4对氢键，包括PD-1的Gln75与PD-L1的Asp26、Arg125形成的3对氢键和PD-1的Thr76与PD-L1的Tyr123形成的1对氢键[8](图1)。

2 PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤细胞免疫逃逸

图1 人源单体PD-1与人源单体PD-L1的聚合物结构[8]

肿瘤细胞通过多种机制来逃避免疫系统攻击与监视的过程称为免疫逃逸，在免疫应答过程中，T细胞启动、活化需识别双信号系统，第一信号来自于抗原肽-主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)与T细胞表面受体(T cellantigenreceptor，TCR)的结合，第二信号由抗原递呈细胞与T细胞表面共刺激分子相互作用而产生[9-10]。共刺激分子有正性分子与负性分子之分，其中PD-1/PD-L1是重要的负性共刺激分子，即免疫抑制性共刺激分子[11]。通常情况下，免疫系统可以识别表达PD-L1的正常人体细胞，杀伤不表达PD-L1的病毒细菌以及肿瘤细胞等抗原，然而当肿瘤细胞大量表达PD-L1，PD-1/PD-L1信号通路持续激活时，免疫系统持续处于抑制状态，可以使肿瘤细胞发生免疫逃逸[12]。

PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤细胞免疫逃逸的作用机制如图2所示，首先，PD-1与配体结合将蛋白酪氨酸磷酸酶1(proteintyrosine phosphatase，SHP1)和蛋白酪氨酸磷酸酶2(proteintyrosine phosphatase，SHP2)募集到T细胞受体周围，抑制磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinaseprotein kinase，PI3K-AKT)的磷酸化，从而抑制PI3K-AktmTOR途径的激活，阻碍了活化T细胞的形成。同时，SHP1，SHP2的募集会抑制T细胞受体近端激酶的激活，阻碍Zeta链相关蛋白-70(ZAP-70)的磷酸化以及下游Ras-MEK-ERK途径激活。在T细胞活化的过程中，T细胞与树突细胞会进行8～20 h的稳定接触。而这些信号通路的改变会阻断T细胞与递呈抗原的树突细胞形成稳定接触，从而中止T细胞的激活[13]。

图2 PD-1对T细胞中主要信号传导途径的影响[13]

3 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂及其在宫颈癌治疗中的研究进展

3.1 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂

PD-1/PD-L1信号通路抑制剂分为单克隆抗体和小分子抑制剂两种类型。目前已有5种抗体型抑制剂在欧美几十个国家上市，包括PD-1抗体Keytruda(Pembrolizuma)、Opdivo(Nivolumab)及 PD-L1 抗 体 Tecentriq(Atezolizumab)、Bavencio(Avelumab)、Im finzi(durvalumab)，这些抑制剂被美国FDA正式批准用于非小细胞肺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、胃癌、膀胱癌等癌症，取得了较好的疗效，能够明显延长患者的总生存期(OS)，且不良反应相对化疗药物较小[14]。PD-1/PD-L1单抗类药物在晚期宫颈癌中的临床研究也正在进行之中，I期试验初步结果显示PD-1抗体pembrolizumab在PD-L1阳性复发或转移性宫颈癌患者中具有良好的抗肿瘤活性。但是PD-1/PD-L1抗体类药物也存在部分患者不响应的问题，甚至出现小部分癌症患者用药后癌症爆发性进展的研究报道，Kato等[15]研究结果显示MDM2/MDM4基因扩增以及EGFR基因畸变的癌症患者应用PD-1/PD-L1单抗类药物后有更高的风险发生肿瘤爆发性进展，具体原因还有待进一步研究。同时PD-1/PD-L1单抗类药物也存在如研发成本昂贵，运输储存不便以及不能口服等问题。

与PD-1/PD-L1抗体类药物的快速发展相比，PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研究进展稍显缓慢。分子设计的困难以及活性位点的位置难以确定是急需解决的问题，现有报道的小分子抑制剂包括印度Aurigene公司合作开发的拟肽类分子以及朱毅敏团队鉴定的靶向PD-L1肽TPP-1等都是基于活性筛选而不是从头合成等计算机实验方法得到。印度的Aurigene公司与Laboratoires Pierre Fabre的研究人员宣布共同开发化合物AUNP-12。该化合物是首个多肽类PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，相比于PD-1/PD-L1抗体药物，AUNP-12具有更短的半衰期，能显著降低免疫相关副作用的发生率。国内关于PD-1抑制剂的研究也取得了一定的成果。清华大学的刘磊教授及其课题组[16]通过镜像噬菌体展示技术发现了一组能够特异性拮抗PD-L1的抗蛋白水解D-肽。该D肽与PD-L1亲和力强，可以有效阻断PD-1与PD-L1的结合，将其应用于临床前治疗也显示出了抑制癌症发生发展的效果。中科院的朱毅敏团队[17]首次运用细胞表面展示技术，通过对任意多肽库和偏向多肽库的筛选，鉴定了以高亲和力与PD-L1特异性结合的靶向PD-L1肽TPP-1。经试验推测TPP-1可以作为肿瘤免疫治疗抗体的替代物。不过以上研究成果均需要大量临床前试验和研究来检验其疗效，应用于临床治疗还有很长一段路要走。

3.2 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在宫颈癌治疗中的研究现状

目前宫颈癌的有效疗法包括手术治疗，放化疗以及分子靶向治疗等方法[18-19]，这些疗法针对早期宫颈癌效果良好，但广泛性子宫切除术由于手术创面大易发生如尿潴留，盆腔脓肿等并发症；放化疗特异性差，易产生恶心、呕吐，肝肾功能损伤等毒副作用。分子靶向治疗虽然增强了治疗特异性，但靶点阴性的患者远期生存率依然不理想。患有复发或转移性癌症的中晚期宫颈癌患者治疗方法与选择更加有限，据报道，使用基于顺铂的化疗方案是晚期宫颈癌一线治疗中最主要的选择，尽管如此，该患者人群的中位总生存期仅略超过1年，治疗给晚期宫颈癌患者带来极大痛苦且效果不尽人意。因此，通过激活免疫系统来抗癌的免疫疗法逐渐成为了科学家们的研究热点。如下我们将分别从PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在宫颈癌治疗中的细胞学实验、动物学实验及临床应用情况进行综述。

3.2.1 细胞学实验相关进展 Saglam等[20]通过流式细胞术分型和免疫细胞亚群计数发现，与子宫内膜癌和卵巢腺癌相比，宫颈癌中肿瘤浸润性炎症细胞中PD-1/PD-L1的表达更高。在宫颈鳞状细胞癌中，与肿瘤和基质之间界面上的边缘PD-L1表达相比，弥散性PD-L1表达是无疾病和疾病特异性存活率差的风险因素。该结论与Heeren等[21]的发现较为相似，说明PD-1/PD-L1信号通路在宫颈癌的发生发展中起到重要作用。Meng等[22]研究发现，与正常组织相比，宫颈癌组织中PD-L1，PD-1更为常见，尤其是那些HPV被强烈染色的宫颈癌组织。Yang等[23]分别检测了40名HR-HPV阴性(或HR-HPV阳性)女性的宫颈T细胞和树突状细胞(DCs)上PD-1和PD-L1的表达。宫颈上皮内瘤变(CIN)等级分别为0，I和II-III，其中CIN1代表低度不典型增生，CINII代表中度不典型增生，CINIII代表高度不典型增生和原位癌。结果显示PD-1和PD-L1在宫颈T细胞和DC上的表达与HR-HPV阳性相关，并且随着PD-1和PD-L1表达增加CIN等级随之增加。上述宫颈癌细胞学实验均说明PD-1/PD-L1信号通路与宫颈癌之间有着密不可分的关系，PD-1/PD-L1信号通路的上调可能促进CIN及宫颈癌的进展。

3.2.2 动物学实验相关进展 HPV致癌基因E7对于宫颈癌细胞的恶性转化和维持至关重要，是疫苗开发的理想肿瘤特异性抗原。然而，由于E7蛋白的免疫原性差，治疗性E7疫苗普遍效果不佳。Liu等[24]使用靶向HPV16E7的新型树突细胞合成疫苗与PD-1/PD-L1通路抑制剂联合在小鼠中引发治疗性抗肿瘤免疫，有效改善了E7疫苗的治疗效果。与Liu的研究结果相似，Moeini等[25]使用HPV16E7疫苗与次级淋巴组织趋化因子(SLC，也称为CCL21佐剂)和PD-1抑制剂联合应用于小鼠宫颈癌模型中，可大大增强细胞毒性T淋巴细胞的产生和淋巴细胞增殖速度，并抑制肿瘤的进展。魏洁等[26]应用PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路联合顺铂处理小鼠宫颈肿瘤，有效抑制了抗癌药物顺铂引起的PD-1过表达，拮抗了PD-1过表达所引起的T淋巴细胞的失活与凋亡，激活了免疫系统的功能，从而增强了顺铂在宫颈癌治疗中的作用。由以上研究结果推测，HPV16E7通过上调PD-L1表达来进行免疫逃逸，过量表达的PD-L1一方面激活PD-1/PD-L1信号通路来抑制T细胞活性，另一方面激活ITGB4/SNAI1/SIRT3信号通路促进宫颈癌细胞的生长和转移。说明将PD-L1/PD-1信号通路抑制剂作为抗宫颈癌免疫治疗的靶点可抑制肿瘤发生发展。同时，将PD-1/PD-L1抑制剂联合应用于抗宫颈癌药物的辅助治疗也有很好的发展前景，可能成为宫颈癌治疗的新策略。

3.2.3 PD-1/PD-L1信号通路抑制剂的临床研究 目前多种PD-1/PD-L1信号通路抗体类抑制剂例如Keytruda(Pembrolizuma)、Opdivo(Nivolumab)，已经在多种癌症例如非小细胞肺癌，胃癌，三阴性乳腺癌，恶性黑色素瘤中进行了临床研究，均取得了较好疗效，并已批准上市。多项免疫抑制剂在宫颈癌中的临床研究也正在进行中，Ib KEYNOTE-028研究的初步结果评估了PD-1抗体pembrolizumab在晚期宫颈癌患者中的安全性和有效性[27]，该项研究中I期试验招募的24位患者均患有不可切除或转移性宫颈癌，并且先前接受全身治疗和标准治疗失败。结果显示患者中位总生存期达到9个月，在预先治疗严重不良的患者群体中效果显著，这表明pembrolizumab具有良好的耐受性，并且在PD-L1阳性复发或转移性宫颈癌患者中显示出较好的抗肿瘤活性，pembrolizumab在晚期宫颈癌中的临床试验正在II期KEYNOTE-158试验中进一步研究。另一项研究是将抗血管生成剂与免疫疗法联合应用进行宫颈癌治疗，贝伐单抗(Bevacizumab)目前与PD-L1抗体atezolizumab在II期临床试验中进行联合治疗[28]。贝伐单抗可通过靶向血管生成关键介质VEGF从而抑制新生血管形成，从而增强抗肿瘤作用。有临床研究报道晚期黑色素瘤中，CTLA-4抗体ipilimumab与PD-1抗体nivolumab联合治疗，在总生存期方面比单独使用ipilimumab效果更好，最近，PD-L1抗体药物durvalumab与CTLA-4抗体药物tremelimumab联合治疗也已经进入晚期宫颈癌I期临床试验研究阶段[29]。上述临床研究的实验结果均表明在由于高危型 HPV感染而导致的宫颈癌患者(尤其对于中晚期宫颈癌)的治疗中，与疗效十分有限的传统疗法相比，开发PD-1/PD-L1信号通路抑制剂将成为治疗晚期宫颈癌的有希望的替代性选择。

4 总结与展望

宫颈癌成为困扰全世界女性的重要癌症之一，有调查显示，发展中国家每年死于宫颈癌的女性在23.5万人以上[30]。PD-1/PD-L1免疫治疗是当前备受关注的一种抗癌免疫疗法，关于宫颈癌中PD-L1表达的临床意义的研究也逐渐增多。过去几年，抗体类PD-1/PD-L1信号通路抑制剂在肿瘤免疫治疗领域已经取得了突破性进展，免疫检测点PD-1单抗类药物也已经进入晚期宫颈癌临床试验研究，且初步结果显示PD-1/PD-L1信号通路抑制剂有希望成为治疗晚期宫颈癌的治疗药物。但仍存在一些问题需要解决，例如用药前需筛选生物标志物，符合标准的患者才能进行注射，若进行无差别治疗，则抗体类PD-1/PD-L1信号通路抑制剂响应率不高。并且在用药后会出现皮肤毒性，肺炎，肝炎及内分泌问题等不良反应。因此寻找有效的生物标志物去筛选适合免疫治疗的患者也是目前需要解决的问题，联合治疗也是未来免疫疗法发展的一个方向。如何降低免疫药物治疗中的不良反应，选择更合适的给药方式与用量，仍需要进一步探索。PD-1/PD-L1信号通路在宫颈癌发生发展过程中的具体作用机制也有待于深入研究。