3种市售蚊香液对植物根尖细胞的遗传损伤效应

李 莹，陈霞明，李函融，罗 特

(厦门大学嘉庚学院，河口生态安全与环境健康福建省高校重点实验室，福建 漳州 363105)

蚊香作为夏季驱蚊的主要产品，主要包括盘式蚊香、电热蚊香片和电热蚊香液3种剂型[1]，其中，电热蚊香液由于其日挥发量小、有效成分稳定等优点广受消费者的欢迎[2]。蚊香液包括杀虫有效成分、溶剂、稳定剂、恢散调整剂及香料等成分，其有效成分多以拟除虫菊酯类为主[3]。然而，随着拟除虫菊酯类物质的广泛应用，随之带来的农药残留超标和环境污染问题日益严重[4]。1998年，美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency，USEPA)已将氰戊菊酯、氯氰菊酯和氯菊酯等拟除虫菊酯类物质列入67种环境内分泌干扰物黑名单[5]。研究指出，拟除虫菊酯是一种重要的神经毒剂，其作用机制与滴滴涕(dichloro diphenyl trichloroethane，DDT)类似，主要通过干扰神经转导而产生毒性作用使害虫致死[6]。同时，拟除虫菊酯作为一类亲脂性杀虫剂，在水体中可直接进入水生动物的血液，并可在其体内富集，引起中毒反应[7]。研究发现氟氯氰菊酯污染物会影响草鱼肝肾的生理功能[8]；联苯菊酯和醚菊酯暴露下，对真鲷的安全浓度分别为0.12μg/L和0.02 mg/L，分别属于剧毒和高毒物质[9]；氰戊菊酯、溴氰菊酯对凡纳对虾的安全浓度分别为0.014和0.011μg/L，均属于极高毒药物[10]；溴氰菊酯暴露会导致淡水中华绒螯蟹肝胰腺MDA含量增加，机体非特异性防御系统受到损伤，肝胰腺正常细胞结构受到破坏，属于高毒物 质[11]。研究还发现，拟除虫菊酯在哺乳动物体内可以被相应的酶类分解代谢，但其对哺乳动物依然具有低毒性，存在致癌、致畸、致突变的潜在威胁[12]。马拉硫磷、毒死蜱、氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯单独与联合经口染毒均可致小鼠骨髓细胞微核率、精子畸形率增加，且联合染毒对小鼠的遗传损伤具有一定的相加作用，具有引起遗传毒性的风险[13]；氟丙菊酯原药对雄性大鼠经口染毒剂量为3.91 mg/(kg·d)及以上，对雌性大鼠经口染毒剂量为3.62 mg/(kg·d)及以上时，可产生毒性效应[14]。对植物的研究发现马拉硫磷、毒死蜱、氰戊菊酯剂量浓度达到10μg/mL时，会对蚕豆根尖细胞造成遗传损伤[15]；13.65 mg/L的辛硫磷、25 mg/L的四聚乙醛对大蒜根尖细胞有较强的染色体致畸变作用[16]。目前，拟除虫菊酯类物质的使用量不断增加，其可通过降雨径流、大气干湿沉降等途径进入土壤和水体，从而在水体及其底泥、农林业用地的水及土壤中大量残留[17]。为更全面地评估蚊香液的生物学作用，开展蚊香液对植物的遗传毒性研究具有重要意义。

微核是常用的遗传毒理学指标之一，常被用来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度[18]，具有灵敏、简便、快速的特点，并与动物试验结果高度一致；植物根尖微核检测技术已广泛运用于检测环境污染物、常用农药等的致突变作用[19-20]。该研究以3种植物蚕豆、大蒜和洋葱作为实验材料，分析不同浓度的蚊香液对植物根尖细胞微核率及微核指数的影响，探讨蚊香液对不同植物遗传损伤程度的差异，同时比较不同品牌蚊香液对植物细胞微核率的差异，以期为蚊香液的安全使用提供参考依据和数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

蚕豆种子，产自山东菏泽。普通大蒜、洋葱、3种品牌蚊香液(BBN、JJ、YB，以品牌名称首字母表示)，均购自福建省漳州市开发区南滨大道丰顺超市；其中，BBN和JJ品牌蚊香液均标明其有效成分为0.8%的氯氟醚菊酯，YB蚊香液标明其“在农药登记证上列为微毒，是农药毒性评级的低级”，而未体现其具体有效成分。

1.2 实验方法

1.2.1 蚊香处理液的制备 根据预实验结果，制备不同浓度梯度的蚊香处理液，将3种品牌蚊香液均用蒸馏水分别稀释4倍、2倍、1.33倍，振荡摇匀，制备成体积浓度为25%、50%和75%的蚊香处理液，蒸馏水作为空白对照组。

1.2.2 微核试验 选取饱满、均匀的蚕豆种子，同时选取长势良好的大蒜和洋葱，分别洗净后置于装有蒸馏水的烧杯和培养皿中，置于室温(若室内温度低于25℃，需放入25℃的恒温箱中)，浸泡24 h，此期间至少换水2次。随后转入装有少量蒸馏水的培养皿中，继续催芽，保持湿度，浸泡24～48 h，期间换水4～6次，待种子生出根长至2～3 cm，选取初生根尖生长良好、根长一致的蚕豆种子、大蒜蒜瓣和洋葱(每颗大蒜蒜瓣和每个洋葱均有多个根尖)，各分为10组(蚕豆每组5～7粒，大蒜蒜瓣每组2～3颗，洋葱每组1个)，分别置于装有不同蚊香处理液的30个发芽盒中，其中，每种植物需用3种蚊香液处理，每种蚊香液各设3个处理浓度，共计9个蚊香液处理组，再设1个空白对照组。室温下培养24 h，供试液需没过完整根尖。将处理后的种子，用蒸馏水浸洗3～4次，从根尖顶端切下1 cm长的幼根放入抗生素空瓶中，加卡诺氏固定液(无水乙醇与冰醋酸按照体积比例3∶1配制)固定24 h，固定后的幼根如来不及制片时，可放入70%的乙醇中，置4℃冰箱内待下次制片。

1.2.3 染色制片 取固定好的根尖，蒸馏水冲洗3 min，加入6 mol/L的盐酸将幼根浸没，室温下酸解10 min，待幼根软化即可。将解离后的幼根水洗3 min并吸干，挑取1个根尖的乳白色分生组织(大约1 mm左右，不宜过大)置于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴改良苯酚品红染液，染色10～15 min。在经染色的根尖上再加1滴染液，盖上盖玻片，覆1层吸水纸，将多余的改良苯酚品红溶液吸去，用带橡皮头的铅笔垂直地轻轻敲打盖玻片，使根尖充分分散压平，便于观察微核。

1.2.4 镜检及微核识别标准 在低倍镜下选择细胞分散均匀、无损伤、染色良好的根尖分生区进行观察，再转高倍镜观察记录细胞的微核数量。微核的识别严格按照国家环保局植物根尖微核试验的规范方法[21]，在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核，小核着色与主核相当或稍浅，小核形态为圆形、椭圆形或不规则形。每个实验组观察6张玻片，选取其中4张计算平均微核率(micronucleus，MCN，‰)和微核指数(即污染指数，pollution index，PI)，每个根尖计数500个细胞中的微核数。

1.3 数据处理

MCN/‰=样品检出微核的细胞数/样品检测的细胞总数×1 000‰

所测样品的MCN与对照比较，PI值≥1.5判断样品对植物造成遗传损伤[21]。

实验结果用Excel 2013计算样品的平均值±标准差，用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，采用LSD法进行差异性检验，采用Duncan法进行组间多重比较，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 3种蚊香液处理植物根尖后细胞的微核观察

镜检发现，3种蚊香处理液均可诱导植物根尖细胞产生微核，且均为单微核，这些微核结构出现的频率与不同蚊香处理液浓度有一定的关系(图1)。

图1 蚊香液处理植物根尖细胞后的微核观察

2.2 不同浓度的蚊香液对植物根尖细胞微核率的影响

如表1所示，BBN、JJ、YB 3种蚊香液的各浓度处理组与对照组相比，微核率均出现不同程度的增加，但仅75%浓度组的增量差异具有统计学意义(P＜0.05)。各浓度处理组微核指数均≥1.5，表明对蚕豆根尖细胞造成了一定的遗传损伤。同种蚊香液不同浓度之间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

如表2所示，3种蚊香液处理组与对照组相比，微核率有不同程度上升，但仅有JJ和YB蚊香液的75%浓度组与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05)。蚊香液各浓度组的微核指数均≥1.5，表明对大蒜根尖细胞均造成遗传损伤。同种蚊香液不同浓度间比较，发现BBN和JJ蚊香液各浓度组处理的大蒜根尖，差异无统计学意义(P＞0.05)；YB蚊香液的25%和75%浓度组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 不同浓度的蚊香液对蚕豆根尖细胞微核率的影响(n=500)

表2 不同浓度的蚊香液对大蒜根尖细胞微核率的影响(n=500)

如表3所示，3种蚊香液处理组与对照组相比，微核率有不同程度的增加，与对照组相比，JJ和YB蚊香液的25%浓度组观察到的微核数较少，差异无统计学意义(P＞0.05)，其他浓度组差异具有统计学意义(P＜0.05)。随蚊香液浓度增加，细胞微核数随之增加，微核指数均≥1.5，即3种蚊香液对洋葱根尖细胞均具有致突变性。同种蚊香液不同浓度之间比较，均存在明显差异(P＜0.05)。

表3 不同浓度的蚊香液对洋葱根尖细胞微核率的影响(n=500)

2.3 3种植物根尖细胞微核率的对比

如图2所示，BBN、JJ和YB蚊香液处理3种植物根尖，随蚊香液浓度增加，蚕豆、大蒜和洋葱的根尖细胞微核率均呈现增加趋势，3种植物对照组微核率间差异无统计学意义(P＞0.05)，即排除试验方法等因素对3种植物细胞微核率的差异。JJ和YB蚊香液75%浓度组处理的洋葱根尖细胞微核率高于对应浓度的蚕豆根尖细胞微核率，差异显著(P＜0.05)。

图2 蚊香液对不同植物根尖细胞微核率对比

2.4 3种品牌蚊香液诱导植物根尖细胞损伤程度的对比

如图3所示，3种品牌蚊香液作用于蚕豆、大蒜和洋葱，产生了不同程度的遗传损伤，微核率随浓度变化具有一致的规律性。微核率在同一浓度3种蚊香液之间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，总体表现为3种品牌蚊香液对实验植物根尖细胞产生的毒性效应差异较小。

图3 3种品牌蚊香液对植物根尖细胞微核率影响的对比分析

3 讨论

本研究发现，当蚊香处理液作用于蚕豆、大蒜和洋葱根尖细胞时，均可诱导植物根尖细胞产生微核现象，其微核率均高于对照组，且随浓度的增加，蚊香液处理液诱导3种植物根尖细胞微核率也随之增加，可能是由于高浓度蚊香液暴露使得细胞有丝分裂会受影响，纺锤体功能得不到正常发挥，从而影响DNA的复制，也可能在这种较高的浓度下，细胞的呼吸作用会受到抑制，影响了细胞生长。杨玉英研究了溴氰菊酯对紫露草根尖细胞的诱变作用，实验显示在一定浓度范围内，溴氰菊酯水溶液浸泡可以使紫露草微核率升高，存在一定的剂量-反应关系[22]。卜宁等在农药氰戊菊酯和三氟氯氰菊酯对蚕豆的致突变研究中发现，在一定浓度范围内，蚕豆根尖细胞微核率会随暴露浓度的升高而增加，同时，这两类拟除虫菊酯还可诱导蚕豆根尖细胞产生较高频率、多种类型的染色体畸变，对蚕豆根尖细胞具有明显的遗传毒性[23]。以上研究均表明高浓度的污染物质可以增加植物根尖细胞微核的产生，对植物的遗传物质产生不同程度的损伤。

本文研究还发现，蚊香液处理可以诱导蚕豆、大蒜和洋葱根尖细胞微核的产生，说明蚊香液对植物可以产生一定的遗传损伤。本研究中，同种实验条件下，高浓度(75%)的JJ和YB蚊香液诱导洋葱根尖细胞微核率明显高于蚕豆(P＜0.05)，而大蒜与二者均无显著差异(P＞0.05)，且低(25%)、中(50%)浓度组的3种蚊香处理液诱导3种植物根尖细胞微核率无统计学差异(P＞0.05)，表现为高浓度蚊香液暴露条件下，洋葱较蚕豆更敏感，中、低浓度暴露对3种植物敏感性差异不大。有研究指出蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性的检测[24]；而与蚕豆相比，大蒜和洋葱作为可用鳞茎进行营养繁殖的植物，其取材方便、遗传性能稳定，每瓣/个鳞茎可以发出数条不定根，用一瓣/个鳞茎作为一个处理可以消除不同个体处理间的个体差异，也常被作为微核试验材料[25-27]。本研究中，由于蚕豆、大蒜和洋葱根尖细胞对蚊香液均具有较高的灵敏性，并在实验浓度范围内具有剂量效应，因此，3种植物根尖细胞微核率在一定程度上可以反映蚊香液的污染程度，可用于蚊香液的污染检测。

本研究以3种市面常用品牌的蚊香处理液对植物根尖进行诱导，其微核率相差不大，未形成明显统计学差异。有研究指出，氯氟醚菊酯对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)幼虫和家蝇(Musca domestica)幼虫的LC50分别为0.94μg/L和4.2μg/g，其防治效果优于四氟甲醚菊酯、四氟苯菊酯和右旋炔丙菊酯这三类拟除虫菊酯农药[28]。也有研究发现阿拉伯按蚊(Anopheles arabiensis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)在含0.08%氯氟醚菊酯的盘蚊香暴露1 h后，二者24 h的死亡率均超过90%[29]，而致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的死亡率可达100%[30]。以上研究均表明氯氟醚菊酯类物质对昆虫表现出较高的毒杀活性。此外，将幼鼠暴露于0.08%氯氟醚菊酯电热蚊香片后，其肝脏谷丙转氨酶(ALT)含量、肝脏器系数、肝脏湿重均显著升高，且肝细胞胞质疏松、部分肝细胞肿胀、嗜碱性小体减少、肝索排列紊乱，表现为组织学异常，呈现出一定的肝脏毒性[31]。结合本研究，拟除虫菊酯类物质可以对动植物产生一定的生物毒性，而市售不同品牌的蚊香产品之间毒性差异尚不明显。