新疆黑种草子总黄酮体外抗宫颈癌活性研究

盛 磊，武贵臻，热娜古丽·热依木，艾尼娃尔·艾克木*

(1．新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；2．新疆医科大学药物分析教研室，新疆乌鲁木齐 830011；3．新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，新疆乌鲁木齐 830011)

黑种草子为毛茛科植物腺毛黑种草(Nigella glandulifera Freyn et Sint.)的干燥成熟种子，在中国新疆有悠久的栽培历史，是当地少数民族常用的药材，被应用于妇科疾病且有较好的疗效[1]。黑种草子除了富含脂肪酸和挥发油外，还含有黄酮类、皂苷类及生物碱类等多种化合物[2]。其中黄酮类化合物由于其药用价值广泛、生物活性强、毒副作用小的特点，在医药领域有着广阔的应用前景和潜在的开发利用价值，一直为国内外的研究热点[3]。以往研究发现，黄酮类化合物具有广泛的抗肿瘤活性[4-9]，但到目前为止黑种草子总黄酮在抗肿瘤方面的研究甚少。基于黑种草子为新疆民族医妇科常用药的特点，本研究以宫颈癌细胞株(SiHa和HeLa)为对象，采取MTT法检测新疆黑种草子总黄酮成分对宫颈癌细胞株的体外抗增殖活性，划痕实验检测新疆黑种草子总黄酮成分对宫颈癌细胞株迁移的影响，使用流式细胞仪检测药物干预前后宫颈癌细胞株的凋亡情况，初步探讨新疆黑种草子总黄酮成分的体外抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

宫颈癌细胞株(SiHa和HeLa)购自中国科学院上海生物化学研究所细胞库。

1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基，购于HyClone公司；胎牛血清，购于Gibco公司；青霉素/链霉素溶液，购于HyClone公司；MTT购于Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒，购于BD公司；新疆黑种草子购于新疆维吾尔自治区民族医院。

1.3 仪器设备

细胞图像观察及采集使用Leica DMI4000B智能型倒置荧光显微镜(Leica公司)；MTT结果检测使用Thermo Multiskan GO全波长酶标仪(Thermo公司)；细胞凋亡率检测使用LSRⅡ流式细胞检测仪(BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基，在37℃、CO2体积分数为5%的条件下分别培养宫颈癌SiHa和HeLa细胞株，每隔2～3 d需更换完全培养基1次，待细胞铺满80%～90%瓶底面积时，使用0.25%的胰蛋白酶消化后按1∶3或1∶4的比例进行传代。

1.4.2 黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞增殖检测 取对数生长期宫颈癌细胞，以2×105个/mL的浓度接种于96孔板，每孔200μL。待细胞贴壁后，分别以2.5、5、10、15、20、25和50μg/mL的黑种草子总黄酮进行体外处理，空白对照组加入等体积的生理盐水。处理24 h后，使用倒置显微镜观察各组细胞形态，加入MTT工作液，37℃孵育4 h后490 nm处检测吸光度D(490)值。按照公式：抑制率=[D(490)对照组-D(490)处理组]/D(490)对照组×100%，计算各浓度下的增殖抑制率，以受试物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制黑种草子总黄酮体外抗肿瘤活性曲线，使用SPSS软件以probit模型计算出黑种草子总黄酮体外抗肿瘤的IC50。

1.4.3 黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞迁移检测 取对数生长期宫颈癌细胞，以2×105个/mL的浓度接种于6孔板，每孔2 mL。待细胞贴壁后，使用10μL枪头在每孔中做一条垂直于板底的划痕，PBS冲洗去除划下的细胞。处理组每孔加入2 mL含药培养基(15μg/mL)，空白对照组每孔加入2 mL无血清培养基，每组3个复孔。分别于处理的0和24 h拍摄并测量划痕宽度，计算每组处理前后划痕宽度的差值(d)。

1.4.4 黑种草子总黄酮体外诱导肿瘤细胞凋亡检测

取对数生长期宫颈癌细胞，以2×105个/mL的浓度接种于6孔板，每孔2 mL。待细胞贴壁后，分别以不同浓度(10、15和25μg/mL)的黑种草子总黄酮进行处理，空白对照组加入等体积的生理盐水。处理24 h后分别收集各组细胞，细胞凋亡检测试剂盒染色后采用流式细胞仪进行检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行MTT检测数据的统计分析，吸光度值结果以xˉ±s表示，两样本均数比较采取t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 黑种草子总黄酮的体外抗肿瘤细胞增殖活性

使用MTT法分别检测黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株SiHa和HeLa的增殖抑制作用，结果发现黑种草子总黄酮均是在浓度为10μg/mL时对SiHa和HeLa细胞株开始发挥增殖抑制作用(P＜0.05)，之后随着浓度的升高黑种草子总黄酮对两种宫颈癌细胞株的抑制率也不断升高，显现良好的量效依赖关系(表1、表2)。以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制黑种草子总黄酮体外抗肿瘤活性曲线(图1)，发现黑种草子总黄酮对两种宫颈癌细胞株具有相似作用效果，均在浓度为10μg/mL时发挥增殖抑制作用，而在20～25μg/mL时进入平台期。分别对两组MTT结果的浓度和抑制率进行Probit回归分析后得到效应概率为50%时的受试物浓度(IC50)，黑种草子总黄酮对SiHa细胞株的IC50为16.935 μg/mL，对HeLa细胞株的IC50为18.366 μg/mL。

表1 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株SiHa的体外抑制作用()

表1 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株SiHa的体外抑制作用()

*独立样本t检验，所列数据均为与空白对照组比较的结果.

组别空白对照组黑种草子总黄酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.561±0.035 0.550±0.027 0.529±0.028 0.506±0.019*0.339±0.072*0.089±0.005*0.089±0.003*0.087±0.002*t 0.500 1.436 2.761 5.527 26.791 26.962 27.179 P*-0.635 0.201 0.043 0.001＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-1.96 5.70 9.80 39.57 84.14 84.14 84.49

表2 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株HeLa的体外抑制作用()

表2 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株HeLa的体外抑制作用()

*独立样本t检验，所列数据均为与空白对照组比较的结果.

组别空白对照组黑种草子总黄酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.929±0.019 0.928±0.017 0.894±0.057 0.843±0.041*0.649±0.023*0.240±0.030*0.085±0.003*0.092±0.003*t-0.079 1.184 3.817 18.605 38.903 87.538 87.099 P*-0.940 0.281 0.009＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-0.11 3.77 9.26 30.14 74.17 90.85 90.10

图1 黑种草子总黄酮体外抗肿瘤活性曲线

2.2 黑种草子总黄酮处理后肿瘤细胞形态学观察

对处理后的宫颈癌细胞进行形态学观察发现：对照组SiHa和HeLa细胞均为单层贴壁生长，细胞个体饱满，透明度大，折光性强，细胞密度达90%以上，SiHa细胞形态为梭形而HeLa细胞为多角形；在处理组中，两种宫颈癌细胞形态均随着药物浓度的增加而逐渐回缩，细胞轮廓清晰，折光性下降，细胞密度逐步降低，死细胞数目增多(图2、图3)。

图2 黑种草子总黄酮处理后SiHa细胞形态学观察(×100)

2.3 黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞迁移检测

图3 黑种草子总黄酮处理后HeLa细胞形态学观察(×100)

通过划痕实验检测黑种草子总黄酮体外对宫颈癌细胞株SiHa和HeLa迁移的影响，结果显示：体外处理24 h后，SiHa和HeLa细胞株空白对照组划痕处细胞均趋于汇合，而处理组划痕处变化不大(图4、图5)。使用处理前后划痕处的宽度差表示细胞的相对迁移距离，结果如表3所示，SiHa细胞株空白对照组的肿瘤细胞相对迁移距离为(223.333±13.868)px，处理组的相对迁移距离为(56.333±10.970)px；HeLa细胞株空白对照组的肿瘤细胞相对迁移距离为(360.667±15.308)px，处理组的相对迁移距离为(13.000±3.606)px，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表3 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株的体外诱导凋亡作用()

表3 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株的体外诱导凋亡作用()

*独立样本t检验，所列数据均为与空白对照组比较的结果.

肿瘤细胞株SiHa HeLa分组空白对照组处理组空白对照组处理组相对迁移距离/px 223.333±13.868 56.333±10.970*360.667±15.308 13.000±3.606*t 16.358 38.290 P＜0.01＜0.01

图4 SiHa细胞划痕实验(×50)

图5 HeLa细胞划痕实验(×50)

2.4 黑种草子总黄酮体外诱导肿瘤细胞凋亡检测

使用Annexin V和PI分别对空白对照组和处理组细胞进行染色，采用流式细胞仪进行细胞凋亡项目检测，结果显示黑种草子总黄酮对SiHa和HeLa细胞均具有诱导凋亡的作用(表4)，并且这种作用随药物浓度的增加而增强，显示出良好的量效依赖关系(图6、图7)。在SiHa细胞中，相对于空白对照组(4.0±0.2)%的凋亡率，低浓度组(10μg/mL)的凋亡率为(8.5±0.5)%，中浓度组(15μg/mL)的凋亡率为(35.9±1.3)%，高浓度组(25μg/mL)的凋亡率为(85.7±1.6)%；在HeLa细胞中，相对于空白对照组(0.4±0.1)%的凋亡率，10μg/mL组的凋亡率为(5.3±0.4)%，15μg/mL组的凋亡率为(11.4±0.8)%，25μg/mL组的凋亡率为(85.9±1.9)%，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)

表4 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株迁移的影响()

表4 黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞株迁移的影响()

*独立样本t检验，所列数据均为与空白对照组比较的结果.

组别空白对照组10μg/mL 15μg/mL 25μg/mL SiHa细胞凋亡率4.0±0.2 8.5±0.5*35.9±1.3*85.7±1.6*t--14.047-41.418-89.319 P-＜0.01＜0.01＜0.01 HeLa细胞凋亡率0.4±0.1 5.3±0.4*11.4±0.8*85.9±1.9*t--20.192-24.870-77.448 P-＜0.01＜0.01＜0.01

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤[10-11]，据2017中国肿瘤登记中心年报显示，我国宫颈癌发病率高(9.6/10万)，每年约有15万新发病例，占世界宫颈癌新发病例总数的28%，每年约有8万名妇女死于宫颈癌[12]。新疆是我国宫颈癌的高发区，其中维吾尔族妇女宫颈癌的发病率是相同地区汉族妇女宫颈癌发病率的3～4倍[13-14]，死亡率居全国少数名族宫颈癌死亡率首位[15]。因此，宫颈癌的防治是新疆地区医疗面临的重要问题。

宫颈癌的治疗采用以手术治疗为主，并辅以放射及化学药物综合治疗。顺铂(DDP)作为宫颈癌常用的化疗药物之一[16]，具有抗癌谱广、疗效确切等特点[17-18]，同时也具有骨髓抑制，肾脏毒性，神经毒性，胃肠道反应，过敏反应，电解质紊乱等一系列毒副作用[19-20]，导致患者生存质量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中止治疗。寻找一种有效的天然抗癌新药，使其与传统化疗药联合使用，降低传统化疗药物的使用剂量，进而减轻化疗的毒副作用，提高患者耐受程度及生存质量，对宫颈癌的治疗具有积极意义。

肿瘤细胞具有两大生物学特性：永生性和迁移性。永生性是肿瘤细胞无限增殖的根本原因，迁移性则是肿瘤发生浸润转移的物质基础。因此，抗肿瘤细胞增殖是抗肿瘤药物的重要特性，如何控制肿瘤细胞的迁移则是肿瘤治疗的另一关键问题。本研究使用黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞SiHa和HeLa进行体外处理，MTT法检测黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞的体外抗增殖作用，结果显示黑种草子总黄酮在体外对SiHa和HeLa细胞均具有较好的抗增殖活性，且对两种细胞株有相似的最大抑制率及IC50。细胞形态学观察进一步支持了MTT检测结果，随着药物浓度的不断增大，肿瘤细胞失去了应有的形态，细胞活力降低，活细胞数目不断减少。划痕实验检测黑种草子总黄酮对宫颈癌细胞的体外抗迁移作用，结果显示黑种草子总黄酮在体外对SiHa和HeLa细胞均具有明显的抗迁移作用。

图6 黑种草子总黄酮对SiHa细胞的体外诱导肿瘤细胞凋亡检测

图7 黑种草子总黄酮对HeLa细胞的体外诱导肿瘤细胞凋亡检测

凋亡是细胞的程序性死亡，在机体的生长发育、免疫耐受等方面发挥着非常重要的作用，同时在整个生命周期中维持着机体的稳态。细胞有增殖、分化和凋亡的特征，三者相互协调，共同调节。有研究显示细胞凋亡作用的失衡与肿瘤的发生密切相关[21]。自1992年Hickman[22]等首次提出诱导肿瘤细胞凋亡可作为肿瘤治疗研究中的主要目标和手段以来，治疗性细胞凋亡干预作为一种发展中的疾病治疗手段，已逐渐成为国内外肿瘤治疗研究的一个热点。本研究细胞凋亡检测结果显示，黑种草子总黄酮在体外可诱导SiHa和HeLa细胞凋亡的发生，且呈现良好的量效依赖关系。综合上述结果分析发现，黑种草子总黄酮具有体外抗宫颈癌细胞株增殖及迁移作用，同时能够诱导宫颈癌细胞株发生凋亡。

综上所述，新疆黑种草子总黄酮可能在治疗宫颈癌方面具有潜在的药用价值，本研究为进一步探索和开发新疆地区道地药材奠定了基础。