虫草素联合吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制

樊华 朱永军 赵永锋

(山西中医药大学 1中医临床学院西外教研室，山西 太原 030001；2附属医院乳腺科)

乳腺癌治疗主要以外科手术和化疗为主〔1，2〕。吉西他滨常用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等〔3～5〕。但由于其毒性和不良反应较多，且患者易出现耐药性，导致化疗药物治疗效果不佳。目前临床治疗癌症已逐渐采用联合用药的治疗方式，以期提高疗效的同时减少化疗药物的耐药性和对机体的毒副作用〔6〕。虫草素是中药冬虫夏草的天然产物，具有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性〔7〕。虫草素作为抗肿瘤的中药之一，在乳腺癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤中表现出较强的抗肿瘤能力〔8～10〕。虫草素在体外能够阻滞肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。中药联合化疗药物的联合用药的方式已成为目前治疗肿瘤的研究热点〔11〕，本实验采用中药虫草素联合化疗药物吉西他滨作用于人乳腺癌MCF-7细胞，观察对细胞、增殖、凋亡及细胞周期的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7细胞株购于美国ATCC公司；虫草素购于大连美仑生物技术有限公司，纯度>98%；吉西他滨购于江苏奥赛康药业股份有限公司；RPMI1640培养基购于美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购于赛默飞世尔科技有限公司；膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于日本TaKaRa公司；噻唑蓝(MTT)试剂、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；超敏电化学发光(ECL)试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；蛋白激酶B(Akt)信号通路激活剂胰岛素样生长因子(IGF)-1购于美国Gibco公司；活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购于武汉艾美捷科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、Akt抗体、磷酸化(p)-Akt抗体购于美国Cell Signaling公司。

1.2乳腺癌细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞在无菌操作条件下置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素)中，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每隔2 d更换1次新鲜的培养液，待细胞生长汇合度至80%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，每2～3 d传代1次。

1.3MTT法检测MCF-7细胞增殖能力 人乳腺癌MCF-7细胞培养至对数生长期时，以0.25%的胰蛋白酶消化细胞，将细胞以5×105个/孔接种于96孔培养板中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。将细胞随机分为4组，虫草素组，加入含虫草素浓度为0.8 g/L的培养液；吉西他滨组，加入含吉西他滨浓度为10 μmol/L的培养液；联合用药组，加入含0.8 g/L虫草素和10 μmol/L吉西他滨的培养液；对照组，不含药物的等量培养液。每组设置6个复孔，分别培养24、48、96 h后检测细胞增殖抑制率，即在每孔细胞中添加20 μl浓度为5 g/L的MTT溶液，于37℃培养箱中孵育4 h，除去上清液，再分别在每孔细胞中添加150 μl二甲基亚砜溶液，置于震荡仪上，避光孵育10 min，待结晶物完全溶解后用全自动酶标仪在490 nm处检测每孔细胞的吸光度值，计算每组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(1-实验组/对照组)×100%，每组实验重复3次取均值。

1.4流式细胞术检测MCF-7细胞周期和细胞凋亡情况 取对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞，将细胞浓度调整为5×105个/ml，分别按照1.3方法加入药物处理各组细胞48 h后，分别收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的固定液重悬细胞，细胞固定后缓慢加入预冷的95%的乙醇，调整乙醇终浓度为75%，置冰上孵育30 min。然后分别加入1 ml终浓度为50 μg/ml的碘化丙啶(PI)和RNA酶，染色1 h后，以流式细胞仪检测各组MCF-7细胞周期分布和细胞凋亡情况。

1.5Western印迹检测MCF-7细胞中蛋白表达水平 乳腺癌MCF-7细胞经含虫草素、吉西他滨、联合用药的培养液干预48 h后，用细胞刮收集细胞，将收集的细胞中加入预冷的裂解液，置冰上裂解，提取各组细胞中总蛋白，用BCA蛋白定量检测试剂盒对所提取的蛋白进行浓度定量测定。各组蛋白样品取等量蛋白(约50 μg)用12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，采用湿转法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，在含5%脱脂奶粉的封闭液中孵育4 h，4℃过夜孵育一抗(均为1∶1 000倍稀释)，室温孵育二抗(1∶3 000倍稀释)2 h，ECL法检测，凝胶成像仪扫描图像，采用Image J图像分析系统分析各条带灰度值，以GAPDH为内参，相对灰度值表示MCF-7细胞蛋白表达水平。

1.6Akt信号通路激活剂对MCF-7细胞凋亡的影响 以终浓度为50 ng/ml的 Akt信号通路激活剂IGF-1作用于联合用药组MCF-7细胞，处理48 h后，以流式细胞术检测细胞凋亡情况。方法同1.4。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组细胞增殖抑制情况率比较 与对照组比较，虫草素组、吉西他滨组及联合用药组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)。与虫草素组和吉西他滨组比，联合用药组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

与对照组比较:1)P<0.05；与联合用药组比较:2)P<0.05；下表同

2.2各组细胞凋亡情况比较 与对照组比较，虫草素组、吉西他滨组及联合用药组细胞凋亡率明显增加，细胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与虫草素组和吉西他滨组比，联合用药组细胞凋亡率显著增加，细胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。见图1、图2、表2。

图1 流式细胞术检测各组MCF-7细胞凋亡率

2.3各组细胞周期 与对照组比较，虫草素组、吉西他滨组及联合用药组G0～G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少(均P<0.05)，吉西他滨组和虫草素组G2～M期细胞明显增加(均P<0.05)。与虫草素组和吉西他滨组比较，联合用药组G0～G1期细胞显著增多，S期和G2～M期细胞显著减少(均P<0.05)。见表3。

2.4各组Akt信号通路激活水平 与对照组比较，虫草素组、吉西他滨组及联合用药组p-Akt蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。与虫草素组和吉西他滨组比较，联合用药组p-Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。各组Akt蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表4。

2.5激活MCF-7细胞中Akt信号通路可部分缓解细胞凋亡 与联合用药组比较，IGF-1+联合用药组细胞凋亡率明显降低〔(53.13±4.24)%vs(33.24±3.57)%，P<0.05〕。见图4。

图2 Western印迹检测各组Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达

组别凋亡率(%)Cleaved Caspase-3Bax对照组1.26±0.090.21±0.020.45±0.05虫草素组25.84±1.181)2)0.61±0.051)2)0.96±0.101)2)吉西他滨组34.04±1.621)2)0.70±0.061)2)0.92±0.111)2)联合用药组51.67±2.951)1.26±1.331)1.77±0.191)

表3 各组细胞周期比率比较

图3 Western印迹检测Akt、p-Akt蛋白表达

组别Aktp-Akt对照组1.06±0.090.31±0.03虫草素组1.05±0.080.19±0.021)2)吉西他滨组1.05±0.100.15±0.021)2)联合用药组1.02±0.090.02±0.011)

图4 流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡率

3 讨 论

随着医学的发展，开展了对乳腺癌的筛查和综合治疗，使得乳腺癌的死亡率有所降低，但并未取得较大改善。究其原因是乳腺癌极易发生转移和侵袭，在对乳腺癌进行化疗过程中患者易产生耐药性，加之化疗药物的毒副作用较大，严重影响乳腺癌的治疗和预后〔12〕。虫草素能够在体外呈浓度依赖性的诱导人肾癌ACHN细胞凋亡，抑制细胞增殖〔13〕。Yu等〔14〕研究显示虫草素处理非小细胞肺癌细胞后，经检测发现虫草素可将细胞周期阻滞在G0/G1期，上调p53、p21等的表达导致细胞损伤增加，并提高细胞凋亡率。都兴范等〔15〕研究发现虫草素对人乳腺癌细胞MCF-7具有一定的抑制增殖、诱导凋亡的作用。吉西他滨是一种新型的脱氧胞苷类似物，能够有效抑制DNA修复和脱氧核苷酸的生成〔16〕。吉西他滨通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗癌作用〔17,18〕。本实验结果显示，虫草素和吉西他滨单用药时均能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期处于G0～G1期，上调Cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平。联合用药具有协同作用，可增强抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。这说明虫草素和吉西他滨联合用药具有协同增效的作用。本实验发现单用药和联合用药组Akt蛋白磷酸化水平显著降低，提示Akt信号通路的活化受到抑制。Akt信号通路在介导肿瘤的生长和发展中具有重要作用，Akt蛋白磷酸化能够促进存活蛋白表达的上调，存活蛋白可抑制凋亡蛋白的表达，导致细胞凋亡受到抑制〔19,20〕。因此，Akt通路的活化能够抑制肿瘤细胞的凋亡〔21〕。虫草素能够通过抑制Akt信号通路的激活同时激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导人胶质瘤细胞凋亡〔22〕。Wang等〔23〕研究显示，虫草素通过抑制Akt信号通路上调Caspase蛋白活性诱发人急性单核细胞白血病细胞凋亡。Jing等〔24〕研究指出，吉西他滨能够通过抑制Akt信号通路促进胰腺癌细胞中Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，激活Caspase-3和Caspase-9诱导细胞凋亡。天花粉蛋白通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途径增强吉西他滨对非小细胞肺癌A549细胞毒性和凋亡诱导作用〔25〕。本实验虫草素和吉西他滨单用药和联合用药处理人乳腺癌MCF-7细胞能够抑制Akt信号通路的激活，提示二者及联合用药诱导MCF-7细胞凋亡与Akt信号通路的活化有关。为进一步研究药物诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制与Akt信号通路有关，本实验在联合用药组MCF-7细胞中施加Akt信号通路激活剂IGF-1，经流式细胞术检测发现，Akt信号通路激活剂IGF-1能够部分缓解由联合用药导致的细胞凋亡。验证了虫草素联合吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡的诱发与Akt信号通路的活化有关。

综上，虫草素和吉西他滨联合使用能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，具有协同增效的作用，其分子机制有Akt信号通路的活化有关。为虫草素和吉西他滨联合用药的乳腺癌临床治疗提供一定的实验基础。