限域石英纳米孔道实时监测点击化学反应

芦思珉 于汝佳 龙亿涛

摘 要 ：点击化学反应具有反应条件温和、高区域选择性等优点，被广泛应用于材料科学、药物科学、生物化学等研究领域。在单颗粒水平上，实时监测点击化学反应过程有助于揭示反应的各向异性及反应机理。本研究以具有电化学限域效应的石英纳米孔道作为传感器，对单个金纳米颗粒（AuNPs）上的点击化学反应进行了实时动态监测。在电渗流的驱动下，炔基化合物修饰的AuNPs进入孔道内部，在Cu+的催化下，AuNPs表面的炔基与金层上的叠氮基团发生点击化学反应，因此，AuNPs在孔道端部的滞留时间增长。相比于未发生点击化学反应时，反应过后 “体积排阻效应”造成的阻断电流频率变大，阻断时间明显增长。因此，基于限域石英纳米孔道的分析方法为在单颗粒水平上实时动态监测化学反应提供了新的研究思路。

关键词 ：点击化学反应; 限域石英纳米孔道; 电化学限域效应; 体积排阻效应; 阻断电流

1 引 言

实时监测和理解化学反应动态过程对揭示化学反应的内在机理起到至关重要的作用。近年来，核磁共振[1]、质谱[2]、拉曼光谱[3]、暗场散射[4]等分析技术发展迅速，并广泛用于化学反应过程的研究。例如，时间分辨近红外光譜被用来研究金纳米材料催化剂表面的一氧化碳氧化过程[5]。 然而，这些技术大多仅可获得成千上万的颗粒或化学分子在反应过程中的平均信息，无法揭示化学反应过程中单颗粒或单分子行为的各向异性以及反应的实时动态过程。此外，化学合成反应制备出尺寸不一、形貌各异的纳米颗粒通常具有各不相同的化学和物理性质[6]。因此，亟需发展一种具有高时间分辨率的新型单颗粒， 分析技术监测溶液中单个纳米颗粒的动态化学反应过程，以揭示化学反应的内在机理。

固体纳米孔道分析技术是一种具有高灵敏度的单颗粒检测手段，具有时间分辨率高、无需化学标记、成本低、操作简便等优势，被广泛应用于分析化学的多个领域[7～9]。固体纳米孔道分析方法是基于解析单颗粒通过限域空间时产生的阻断离子流，进一步获取单颗粒个体行为的分析方法[0～12]。其中，石英纳米孔道是一类特殊的固体纳米孔道，是由石英毛细管拉制而成尖端尺寸可调的锥形纳米孔道，被广泛应用于核酸检测[3]、蛋白质检测[4]、抗原抗体识别[5]、单细胞分析等领域[～18]。石英纳米孔道分析技术多是基于 “体积排阻”和“表面电荷”两个效应实现分析检测。其中，“体积排阻效应”是由于目标分析物进入限域纳米孔道，进而电解质离子的传输被阻断，最终导致离子流降低[9]，研究者利用抗原与抗体特异性识别后体积增大造成阻断电流变大的原理，对甲胎蛋白进行了实时动态监测[20]; “表面电荷效应”则是由于目标分析物的表面电荷通过静电相互作用改变孔道内离子的分布，进而改变离子流的大小[9]。研究表明，由于纳米氢气泡表面负电荷有助于增强离子流，因而“表面电荷效应”抑制了“体积排阻效应”，最终离子流得到显著增强[21]。

点击化学反应是一类将小单元结构分子快速拼接成各样不同大分子的化学反应，具有操作简单、原料易得、反应条件温和、产率高等优点。其中，Cu+作为催化剂催化叠氮炔烃环加成反应是一类典型的点击化学反应， 广泛应用于大分子合成、表面功能化修饰、生命分析化学等研究领域[4]。本研究利用具有电化学限域效应的镀金石英纳米孔道作为传感器，在单颗粒尺度下实现了实时监测动态点击化学反应。未被修饰的金纳米颗粒（AuNPs）在电渗流的驱动下向表面镀金的石英纳米孔道运动，当其经过孔口的限域空间时，由于“体积排阻效应”造成离子流的下降。炔基修饰的AuNPs在电渗流的驱动下进入叠氮根修饰镀金石英纳米孔道时，Cu+催化叠氮和炔基发生点击化学反应，AuNPs因而被连接到石英纳米孔道的金层之上，最终使得“体积排阻效应”造成的离子流阻断时间变长。实验结果表明，具有电化学限域效应的镀金石英纳米孔道作为传感器，可在单颗粒尺度上对点击化学反应过程进行实时动态监测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

PatchClamp数模放大器、DigiData 1440A模数转换器、PatchClamp 10.4数据读取软件、ClampFit10.4数据处理软件（美国Axon Instruments公司）; P2000 CO2激光拉制仪、石英管（美国Sutter仪器公司）; Matlab软件（美国Matlab公司）; Origin 8.0（美国OriginLab公司）; 法拉第屏蔽箱、防震台（北京洪升外贸有限公司）; 0.25 mm银丝（美国Sutter仪器公司）; 场发射扫描电子显微镜（德国蔡司仪器公司）; KCl、HAuCl4（SigmaAldrich有限公司）; 丙酮（纯度>99%）、乙醇（纯度>99%）、柠檬酸三钠、CuCl2、抗坏血酸钠（上海国药试剂有限公司）。其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水（电导率为18 MΩ cm），由 MilliQ 纯水仪（美国Millipore 公司）制备。

2.2 实验方法

2.2.1 AuNPs的制备及修饰 AuNPs采用化学还原法制备，50 mL 0.01% 氯金酸溶液加热至沸腾，将5 mL 38.8 mmol/L柠檬酸三钠水溶液迅速加入至沸腾溶液中，将混合溶液持续加热15 min后即可得到颜色为酒红色的AuNPs溶液。叠氮化合物、炔基化合物的具体合成方法参考本课题组已建立的方法[4]。取100 μL 1 mmol/L 炔基化合物加入到6 mL制备的AuNPs水溶液中，利用NaOH溶液将混合溶液调至pH 9，搅拌混合溶液24 h，即可得到炔基化合物修饰的AuNPs。

2.2.2 锥形镀金石英纳米孔道的制备及修饰 首先使用激光拉制仪制备锥形石英纳米孔道，分别用丙酮、乙醇、水清洗石英毛细管15 min，将清洗干净的石英毛细管置于氮气气氛中，使其干燥。将干燥清洁的石英玻璃管置于P2000 CO2激光拉制仪中拉制成尖端为锥形的石英纳米孔道。利用电子束蒸镀方法在管道内壁镀金，将制备好的石英纳米孔道固定于硅片之上，随后将负载有石英纳米孔道的硅片放置于电子束蒸发镀膜机中，蒸镀速率为1 /s[7]。利用微量注射器将1 mmol/L叠氮化合物乙醇溶液注入镀金石英纳米孔道中，以5500 r/min离心，使得叠氮化合物溶液充满石英纳米孔道，反应24 后将化合物溶液吸出，然后用无水乙醇溶液清洗管道内壁数次。