利用单颗粒气溶胶质谱仪分析细菌气溶胶颗粒

曾真 喻佳俊 刘平 黄福桂 陈颖 黄正旭 高伟 李梅 周振 李磊

摘 要 ：大气中悬浮的活性生物气溶胶通过人的呼吸系统进入人体内，会对人体的健康造成一定影响，因此活性生物气溶胶的检测极其重要。近年来，越来越多的研究尝试将单颗粒气溶胶质谱（SPAMS）技术应用于大气生物气溶胶监控领域。本研究利用SPAMS对13株已知菌株进行分析检测发现，不同活性细菌气溶胶的单细胞谱图之间具有较高的一致性，因此较难对菌株进行鉴定。但是，活性细菌气溶胶的常见峰与大气其它细颗粒的特征峰有较大差异，如活细菌气溶胶存在m/z 30、70、72、74、86、88、110和120等氨基酸碎片离子峰，以及m/z-26、42、79、97和159等氰酸和磷酸盐离子峰。进一步对外场大气气溶胶进行检测发现，上述负离子峰较稳定，可作为细菌气溶胶的特征峰，实现快速在线识别活性细菌气溶胶的目的。

关键词 ：单颗粒气溶胶质谱仪; 活性生物气溶胶; 在线识别

1 引 言

大气中的生物气溶胶通过人的呼吸进入体内，对人类健康形成潜在危害。此外，生物气溶胶还可作为云凝结核，参与云的形成，从而对气候产生重要影响。生物气溶胶在大气中的数量比例可达30%以上[1]，当空气中具有传染性的活性生物气溶胶达到一定浓度时，极易导致传染性疾病的大规模爆发。因此，建立快速的大气活性生物气溶胶检测与鉴定的方法极为重要。

常见的生物气溶胶实时在线检测方法是基于荧光检测的光学粒子计数器法[2]。由于生物体内的某些蛋白在特定波长的激光照射下会激发荧光，通过对荧光信号的检测颗粒物的生物活性， 从而达到生物气溶胶的鉴别目标。然而，这种检测技术仅能通过荧光信息进行判断，一方面，不同生物气溶胶种类对激光波长的选择不一致;另一方面，基于荧光的检测易受到无机物的干扰，导致误判。研究表明，多环芳香族碳氢化合物（PAH）也具有类似生物气溶胶的荧光特性[3]，因此，在PAH浓度较高的区域难以实现生物气溶胶的区分与识别。此外，香烟烟雾等也会产生与生物细菌相类似的荧光特性。单颗粒气溶胶质谱（SPAMS）[4]是一种能够实时分析单个气溶胶颗粒物粒径与化学组成的方法，通过获取每个气溶胶颗粒物的质谱指纹图谱，即可实现气溶胶颗粒物的定性与来源分析。近年来，SPAMS的生物气溶胶检测技术得到较快发展。Stowers等[5]开发了荧光预筛选单颗粒质谱仪，通过荧光法筛选出潜在的生物气溶胶颗粒，然后经过激光解离质谱进行检测。 McJimpsey等[6，7]改进了气溶胶飞行时间质谱仪（ATOFMS）的结构，可实时在线原位检测空气病原微生物和生化战剂。 Zawadowicz等[8]发现，此前作为生物气溶胶识别峰的CN、CNO、PO2、PO3离子峰在含磷矿物粉尘和富磷燃烧副产物的负谱图中也很常见，因此容易在鉴定时混淆，而新开发的机器学习算法可通过计算谱图中CN/CNO与PO2/PO3的比例， 较为准确地区分生物气溶胶与其它扬尘。Steele等[9]检测了枯草芽孢杆菌黑色变种，从获得的单颗粒谱图分析主要离子峰来源于精氨酸、吡啶二羧酸及聚谷氨酸，但由于能量的影响，单个颗粒间的谱图存在差异，导致难以区分相近的芽孢杆菌种。Fergenson等[0]采用生物气溶胶质谱仪，利用特征离子峰成功将苏云金芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌从其它生物和非生物环境中辨别出来。Tobias等[1]利用单颗粒质谱仪检测了H37Ra结核分枝杆菌，并根据特征离子峰将其成功与耻垢分枝杆菌和蜡样芽孢杆菌区分开。随着商品化SPAMS的普及，利用SPAMS开展气溶胶研究的工作逐年增多，包括表征不同排放源的质谱指纹图谱、大气颗粒物来源解析和大气化学过程研究[2～14]等，但国内还未有利用该仪器分析生物气溶胶的研究。

本研究利用自行开发的高性能SPAMS，对13株已知菌株进行检测，尝试寻找生物细菌的单颗粒质谱指纹特征，以此作为空气中活性细菌气溶胶的识别峰。

2 实验部分

2.1 SPAMS

单颗粒气溶胶质谱仪为广州禾信开发的商品化的SPAMS 0525[5]。 简言之，SPAMS利用空气动力学透镜将气溶胶从大气环境引入到真空系统并聚焦成准直颗粒束，随后两束连续激光用于测定颗粒物的飞行速度，并依此计算颗粒物的空气动力学直径。高能量的脉冲激光器在颗粒物达到离子源中心处将颗粒物电离成正负离子，用飞行时间质谱进行检测。本研究使用的SPAMS在原有的基础上进行了性能的提升，一方面，采用延迟引出技术[6]提高了飞行时间质谱仪的分辨率;另一方面，采用多通道叠加的信号采集系统[7]实现大、小信号同时检测，大幅提升了仪器检测的灵敏度和动态范围。

2.2 生物细菌采样

本研究检测的13株细菌中有8株细菌采自广州市黄埔区开发区加速器产业园区食堂，并利用16S rRNA测序技术（苏州金唯智生物科技有限公司）进行鉴定，分别为藤黄微球菌、头状葡萄球菌、克氏库克菌、科氏葡萄球菌、西宫皮生菌、人葡萄球菌、海生庫克菌、溶血葡萄球菌。另外5株标准菌株购自广东省微生物研究所，分别为恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、宋氏志贺氏菌。

2.3 细菌检测

取保存的13株细菌，在LB固体培养基上进行复壮培养，后转接单菌落至LB液体培养基（Solarbio， L1010，中国）培养24 h。取50 mL浑浊LB液体培养基，以6000 r/min离心15 min，沉淀即为纯菌体。利用灭菌蒸馏水（MilliQ纯水仪）将纯菌体清洗3次，然后加入30 mL灭菌纯水，混匀后倒入9302A气溶胶发生器（美国TSI公司）中。气溶胶发生器产生的细菌单颗粒气溶胶经扩散干燥管干燥后进入SPAMS进行检测。SPAMS采集的粒径范围为0.1～5.0 μm，分辨率达到1200，质谱测量范围为m/z50～+250， 每株细菌收集742张谱图。细菌检测流程见图1。

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