氧化苦参碱对非酒精性脂肪性肝炎大鼠的保护作用及机制研究

齐慧慧 覃霞

近年来，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为全球常见的慢性肝病，其中有10%～30%的患者可进展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)[1-2]。氧 化 苦 参 碱 (oxymatrine，OMT)是中药苦参的主要成分，含量丰富，提取简单。目前研究指出槐果碱、布渣叶、抗脂方、姜黄素等药物对NASH有治疗作用[3-6]。但氧化苦参碱对实验性大鼠NASH是否有治疗作用尚未有报道。

资料与方法

一、一般资料

(一)动物及饲料 30只6 周龄SD大鼠，SPF 级，体质量 200～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002]。实验动物饲养于海军军医大学动物房。普通饲料购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，高脂饲料(88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇)购于南通特洛菲饲料科技有限公司。

(二)药物及试剂 OMT购自苏州医药有限公司，批号 20100410；水合氯醛购自上海展云化学试剂有限公司；油红O、HE染色相关试剂购于苏州中芯启恒有限公司；ALT、AST检测试剂盒购于南京宏哲生物试剂耗材公司;TC、TG、HDL、LDL检测试剂盒、IL-6、TNF-α单克隆抗体、TGF-β1 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程制剂公司。

(三)仪器 精密电子天平(Mettler Toledo公司)；—85℃超低温冰箱(Harris公司)；低温离心机(德国Pharmacia公司)；紫外分光光度仪(Pharmacia公司)；恒温水浴振荡器HZS-H型、回转式切片机(哈尔滨东联有限公司)；Olympus A H-2型显微镜(日本Olympus公司)；电热干燥箱KWY-450型、(武汉实验仪器厂)；紫外分光光度仪80210620型(德国Pharmacia公司);扩增仪 BiometraU NOIIT hermocyclerT 3 型(BiometraU NOII 公司产品)；琼脂糖凝胶电泳仪 FD201 型(北京 61 仪器厂产品)。

二、实验方法

(一)氧化苦参碱溶液配比 将适量的氧化苦参碱粉末溶于水中摇匀，配比成8 mg/mL的氧化苦参碱溶液。

(二)动物分组和处理 将SD大鼠随机分成 3组，分别为空白对照组(10只)、模型组(10只)、OMT治疗组(10只)。空白对照组给予普通饮食，模型组OMT治疗组均给予高脂饮食16周，并于第8周末分别给予同等量的生理盐水、氧化苦参碱溶液灌胃；第16周末，将所有SD大鼠禁食12 h后称重，麻醉、取下腔静脉血，分离血清，并称肝重；肝脏称重后部分液氮冻存,部分4%多聚甲醛固定。根据大鼠肝指数、脂肪变、纤维化诊断标准证实模型组NASH模型造模成功。

(三)血清指标检测 切取全部肝脏，称肝重，计算肝指数(肝指数 = 肝脏质量/体质量×100% )；运用自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase、ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase、AST)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride、TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein、HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein、LDL)变化。

(四)肝组织相关炎症因子mRNA表达检测 用RT-PCR技术检测大鼠肝组织中白介素-6(interleukin-6、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α、TNF-α)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)mRNA表达水平。

(五)肝脏病理 将石蜡包埋的肝组织，行 HE 染色、V-G 染色、苏丹Ⅲ染色观察肝组织炎症反应程度、纤维沉积情况及脂肪变性程度。

三、统计学分析

结 果

一、对大鼠质量、肝指数的影响

第16周，所有SD大鼠均无死亡；第16周末，模型组大鼠体重、肝指数均高于对照组(P<0.01)，OMT治疗组大鼠体重、肝指数低于模型组(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠终末体重和肝指数比较(±s，n=10)

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组组比较，#P<0.01

二、对大鼠肝功能的影响

三、与正常组比较组比较，模型组大鼠血清 ALT、AST明显升高(P<0.01)。与模型组比较，OMT治疗组 ALT、AST明显降低(P<0．01)。见表 2。

表2 各组大鼠肝功能指数比较(±s)

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组组比较，#P<0.01

三、对大鼠血脂的影响与正常组比较，模型组大鼠血清 TC，TG，LDL-C 水平均显著升高(P<0.05)，HDL-C 含量下降(P<0.05)。与模型组比较，氧化苦参碱治疗组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量水平无明显下降(P>0.05)。见表 3。

四、对大鼠肝组织IL-6、TNF-α mRNA表达的影响与正常组比较，模型组大鼠肝组织 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较，氧化苦参碱治疗组大鼠肝组织 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表达明显增加(P<0.01)。见图1。

表3 各组大鼠血脂指标变化(±s)

注：**P<0.05,与对照组比较；##P<0.05与模型组组比较

注：*P<0.01,**P<0.05与对照组比较；#P<0.01与模型组组比较

图1各组大鼠肝组织mRNA表达比较

五、对大鼠肝组织病理形态学影响

与空白组计较，模型组大鼠肝组织HE 染色、苏丹Ⅲ染色、V-G 染色显示肝组织炎症、脂肪变性程度、纤维化程度明显加重。与模型组比较，OMT治疗组大鼠肝组织HE 染色显示肝组织炎症反应程度明显减轻；苏丹Ⅲ染色显示肝细胞脂肪变性程度明显减轻；V-G 染色显示肝组织纤维化程度明显减轻。见图2。

图2 OMT对小鼠肝脏形态学变化的影响(HE×400)

讨 论

目前多项研究证实中药对NASH有较好的治疗作用。氧 化 苦 参 碱 是传统中药草本苦参的主要有效单体，含量高，提取较易，结构与槐果碱类似。有研究表明槐果碱有改善实验性大鼠肝功能、抑制炎症因子、减轻肝纤维化程度、抗肿瘤的作用[7-10]。但尚未有关于氧化苦参碱对NASH的治疗研究。本实验通过高脂饮食成功建立大鼠NASH模型，并通过给与氧化苦参碱灌胃观察是否有保护作用及机制探讨。

在NASH发病机制中认为，过量的热量或不适当的摄入增加了肝细胞中的有害游离脂肪酸(free fattyacids，FFA)和脂代谢物(LPC、胆固醇和神经酰胺)的生成，导致肝脂肪变性和肝细胞损伤[11-12]。本研究结果显示OMT可显著降低NASH大鼠的血清ALT、AST水平；HE 染色、苏丹Ⅲ染色显示OMT治疗组大鼠肝组织炎症反应程度、肝细胞脂肪变性程度明显减轻；这可能与OMT保护肝细胞、减少肝细胞中有害FFA和脂代谢物的生成、减轻肝脂肪变性相关。本研究结果还发现，OMT可显著下调肝组织中 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表达，这可能与其减少肝脏库普弗细胞(Kupffer cell)的炎症反应和肝星状细胞(hepatic stellate cells ,HSCs)的纤维化反应导致的炎症因子产生减少密切相关，从而进一步缓解肝脏的炎症及纤维化进展，本实验OMT治疗组大鼠V-G 染色显示肝组织纤维化程度明显减轻也进一步证实了这点。总之，OMT对大鼠NASH 进程有显著保护作用，可能与其能改善肝功能，抑制炎症因子表达，减轻肝细胞脂肪变性及肝纤维化相关。