蛋白质组学在绵羊育种中的应用

齐骜穹，曾 莎，王燕新，廖圆圆，蔡 勇，杨具田

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

细胞是一种通过大量不同性质的相互协调机制完成自我复制和适应外界环境改变等过程的个体，是生物体结构与功能的基本单位[1]，理解细胞功能和细胞间信息交流是现代生物学的基本目标.DNA包含必要的遗传信息，形成一个具有结构性或功能性的有机大分子.中心法则描述了一个信息流，从DNA到RNA再到蛋白质.然而近年来的研究成果使得这一法则遭遇到了挑战[2].表观遗传、剪接、非编码RNAs(包括microRNAs，miRNAs和lncRNA)、蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)和翻译后修饰(Post-translational modification，PTM)等都说明了基因型对表型的影响并不是惟一的.蛋白质作为细胞内关键的功能实体，表达了细胞功能的主要信息，故对蛋白质进行全面的分析也是理解细胞功能和细胞间交流的重要途径，这种研究方法被称为蛋白质组学[3].

1 蛋白质组学

蛋白质组是指一个基因组或一类细胞表达的蛋白质总和[4].目前暂时定义为特定时空存在于细胞、组织、器官和有机体内的全套蛋白质[5].随着蛋白质组的提出，产生了蛋白质组学，以蛋白质作为研究对象，检测细胞、组织或有机体内全部蛋白质的组成、蛋白质的表达水平以及蛋白质修饰，以了解PPI以及蛋白质动态变化规律的学科[6].

蛋白质组学作为后基因组时代的重要探究方法之一，受到了研究学者的关注.然而，蛋白质组水平上收集数据的难度远远大于基因组水平和转录组水平上的数据收集.氨基酸作为组成蛋白质的基本结构具有高度不同的理化性质[7].此外，蛋白质通过不同的剪接、多样化修饰和复杂的降解所形成的巨大网络体系，使蛋白质的功能信号在这个高度发散的网络体系中被进一步放大.

通常，蛋白质组学研究的第一步是从细胞、组织或体液中提取蛋白质，并根据研究目的对样品进行预分离(例如离子交换色谱法)，然后用液质联用(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)对这些组分进行分离并进行分析.其中根据选择的肽段长度不同，通过串联质谱进行分段，再使用数据库搜索引擎进行输入，以确定相应的肽序列，最后分配的肽序列组装成蛋白质，对所获得的数据进行统计.通过搜索与随机数据库估算假阳性鉴定率推断肽序列，从得到的MS谱图直接检测蛋白质数据库的可用性.蛋白质组学的研究步骤比较复杂，主要依靠三部分技术，分别为蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术及蛋白质信息查询技术[8].蛋白质分离作为蛋白质组学研究的核心，多采用双向凝胶电泳技术(2D-PAGE)[9]，其原理是根据蛋白质的等电点和相对分子质量对蛋白进行分离，这样就能很好地溶解大量蛋白质并进行定量分析.分析发现其具有高通量、重复性好、敏感度高等优点[10，11].而对于氨基酸组分分析，由Edman在20世纪50年代所创立的Edman降解法，可以检测氨基酸N段序列，以检测蛋白质的一级结构.尽管Edman降解法测序能获取较为精确的肽序列，但其试验成本偏高，且测序速度偏慢.而另一种氨基酸组成分析法是根据差异蛋白质所具备的特定氨基酸和空间构造来鉴定蛋白质序列.虽然成本较为低廉，但灵敏度不高，且需要大量蛋白质或多肽样品，在微量分析中会遇到极大限制，并且存在部分酸水解不彻底或某些氨基酸结构出现缺失等缺点[12].为了更好地探究，质谱技术在蛋白质组学研究的过程中被普及.蛋白质大分子先经过离子转化设备转变为气态离子，接着在分析仪器中依据离子的质荷比进行分离.分离后的离子顺次进入检测器，进而取得不同质荷比的谱线，即为质谱技术[13].目前，常用的质谱分析仪为基质辅助激光解析离子化质谱和电喷雾离子化质谱[14].蛋白质组学的研究还需要和生物信息学相结合.目前应用于蛋白质组学研究的数据库有蛋白质信息资源PIR、蛋白质序列数据库SWISS-PROT、蛋白质家族和结构域数据库PROSITE、蛋白质序列指纹图谱数据库PRINTS、蛋白质三维结构数据库PDB、蛋白质二级结构数据库DSSP以及氨基酸索引数据库(amino acid index)等.此外，现在还开发了多种iTRAQTM数据库用于搜索和分析生物信息元件，其中MASCOT是目前应用最为广泛的搜索引擎软件[15-16].

近年来，蛋白质组学技术，特别是以质谱为基础的蛋白质鉴定，通过仪器的更新换代，样品制备和计算分析技术的累积而日臻成熟，不仅体现在基础理论的研究，也进一步扩展到应用研究领域当中[17].

2 蛋白质组学在绵羊育种研究中的应用

2.1 研究背景

全世界拥有不同生产性能的绵羊近600个品种，是一个丰富的基因储藏库，从短尾型绵羊、细长尾型到肥尾型，从细毛羊、半细毛羊到无绒毛羊，从专用品种到三种品质兼而有之的新型品种，都拥有丰富的品种.大量的绵羊品种因为生产性能和基因特点的各不相同，不仅保证了养羊业产品的多样性，还为育种工作提供了无尽的可能性，以达到改良现有品种的生产性能，培育多种优良生产性能集于一身的新品种和具有新品质的新品种.因此通过各种新兴技术为绵羊育种工作提供新思路、新方法已经成为畜牧业工作者和现代养羊业的重要课题[18].

2.2 绵羊育种方向

目前，绵羊育种研究主要包括羊肉品质的提升、绒毛羊的产绒量和绒毛品质的提升、公母羊生产力的提升以及一些羊副产品品质的提升.

肉用羊肉品质的改变主要分为两个方面：脂肪沉积和肌肉发育.通过调控肌肉的生长发育和肌内脂肪、肌间脂肪、内脏脂肪和皮下脂肪的沉积，从而提升产肉量和改善羊肉品质.绒毛用羊则主要围绕绒和毛的产量和品质进行选育，通过对毛囊细胞和组织的研究，从而改善绒和毛的生长情况，进一步获得符合生产需要的性能.繁殖力的提升主要围绕提高公羊精子质量和母羊受胎率进行研究.

2.3 蛋白质组学在绵羊育种的应用

利用目前较为成熟的蛋白质组学技术，可以对绵羊育种在蛋白质水平上进行一系列新的研究.Bouley等[19]采用2-DE技术和质谱技术完成了羊的半腿肌蛋白质表达谱的构建，检测到500多个可重复的蛋白质位点，然后又使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的方法鉴定了其中的129个蛋白质位点.这些蛋白质中，大部分涉及到代谢、细胞结构、细胞免疫，并且肌钙蛋白存在多种异构体，这可能导致屠宰后的肌肉代谢和肉品质发生改变.M.Hamelin[20]等用2-DE的方法对特塞尔绵羊肌肉肥大的遗传性状进行研究，发现在肌肉肥大型个体中，与糖酵解相关的蛋白质表达量上调，转铁蛋白的表达量增加，而α-抗胰蛋白酶的表达量降低.这可能是两种蛋白的相互作用，导致了肌肉肥大性状的产生.Ana M等[21]研究了季节性减重对绵羊的影响，以便筛选出对季节性减重有较强抵抗力的品种.试验选取三种澳洲本土绵羊，一共鉴定出668种蛋白质，其中95种是差异调节蛋白.筛选出三种季节性减重抗性相关蛋白质，对绵羊肉制品生产工程做出巨大贡献.Promeyrat等[22]发现了铁蛋白和抗氧化性相关蛋白潜在，标记着蛋白质氧化的过程，并且简述了白蛋白、氧化还原蛋白、膜联蛋白、脂类转运蛋白和有氧呼吸酶的作用，这项研究以蛋白质氧化为重点，清楚地表明，在机体老化过程中，需要结合几种标记物来评估肉类对氧化的敏感性.Vincenzo Cunsolo等[23]通过比较研究发现，羊奶比牛奶更具有潜在过敏性.通过SDS-PAGE和LC-MS技术对羊奶中的乳脂蛋白进行了研究，鉴定出718种与牛奶不同的蛋白质成分，其中644种是绵羊所独有的基因，其中193种蛋白质是以前从未发现过的，包括具有健康促进效益的异质组分.MitraArianmanesh等[24]以单侧妊娠母羊为研究对象，比较妊娠母羊不同阶段子宫角功能蛋白的特异性表达差异.研究发现了EPCR蛋白质，包括AHCY和HSP60表达量上调，表明这些蛋白质的上调是为了提供更适宜妊娠母羊的子宫环境.WeiboRen等[25]以过度放牧和适当放牧的绵羊为试验对象，对其肝脏沉积脂肪进行试验，试验用同位素标记的相对定量和绝对定量(iTRAQ)方法分析羊的肝组织蛋白质表达谱的差异，发现41种蛋白质在两个群体中的表达出现差异，大部分差异表达的蛋白质参与蛋白质代谢、转录和翻译调节与免疫应答等过程.

脂尾型绵羊与生俱来的尾部富集脂肪，逐渐不符合产业化的生产需要，所以在育种工作中对其进行趋向瘦尾化的改良已成为一种必然的趋势.韩吉龙等[26]选取了五种尾型绵羊，并对尾部脂肪所检测到的蛋白质进行了差异表达分析.实验先对尾脂的总蛋白进行了鉴定，通过Label-free，发现脂肪细胞分化及脂肪酸合成相关的蛋白质在脂尾型绵羊中高表达.同样高表达的还有参与脂肪代谢和解脂相关的蛋白质.通过蛋白质表达定位发现，FABP4和ERK2在尾脂中的表达量较高.前者参与前体脂肪细胞分化过程和脂肪酸的转运功能，而后者可能与幼龄个体中早期脂肪组织中前体脂肪细胞增殖和分化相关联.这表明，以FABP4、ERK2为主的蛋白质对于脂尾型绵羊早期尾部脂肪的发育具有重要影响.同时他们还对早期尾脂中所鉴定到的蛋白质进行了磷酸化蛋白质检测，鉴定出了分布在804个具有磷酸化修饰蛋白质上的1493个磷酸化位点.其中435个磷酸化差异表达蛋白参与细胞骨架的合成、PTM过程的正调控、蛋白质分解代谢调控、翻译起始和细胞凋亡通路调控等15个生物学进程，显示出不同脂尾型绵羊的早期尾部脂肪发育与磷酸化修饰差异存在一定的相关性，其中以ERK1和ERK2为主的蛋白类激酶经过序列分析，发现可能调节早期尾部脂肪中相关蛋白质的磷酸化修饰，并对尾脂中前体脂肪细胞增殖分化有正向调控作用.

蛋白质组学对绵羊育种行业起到了重大作用，它的出现大大推动了分子育种的发展.蛋白质组学不仅可以在蛋白质水平上对绵羊的各种生产性能进行创新型的研究，还能对前人在绵羊基因组和转录组得到的结果进行一系列的验证，以保证研究的准确性.所以蛋白质组学的出现对于绵羊育种来说具有革命性的意义.

3 展望

蛋白质组学作为21世纪生命科学的重要技术和主要研究方向[27]，其技术已经被广泛地应用于与生命科学相关的各个领域，也为生命科学及其相关学科带来了新的研究方法和理念[28].随着蛋白质组学研究的深入，与蛋白质组学技术相结合的畜牧行业前景更加宽广，它将是人们深入研究改良羊肉品质、选育优良品种、提高繁殖性能和通过饲料加速生长的新途径，也为广大畜牧业工作者指明了新的道路.