可手术的非小细胞肺癌患者外周静脉血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度的临床价值研究

2019-10-08贾殿军王利军程险峰

医学信息 2019年4期

贾殿军王利军程险峰

摘要：目的探讨定量检测可手术的非小细胞肺癌患者外周血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度的临床价值。方法选择2017年1月～12月承德市中心医院胸外科60例可手术的非小细胞肺癌患者为实验组，分别于手术前1 d、手术后7 d、手术后20 d采集外周静脉血液标本，同期于承德市中心医院体检中心选择60例健康体检者为对照组，采集外周静脉血液标本，定量检测两组标本血液中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度，进行统计学分析。结果实验组患者手术前1 d外周静脉血中cfDNA总浓度较对照组升高，差异具有统计学意义（P<0.05）;实验组患者术后7 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）;实验组患者术后20 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d、术后7 d降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组患者手术前1 d外周静脉血中长片段DNA浓度高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）;实验组患者术后7 d外周静脉血中长片段DNA浓度较术前1 d无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）;实验组患者术后20 d外周静脉血中长片段DNA浓度较术前1 d、术后7 d降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论外周静脉血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度可间接反映非小细胞肺癌患者肿瘤负荷状况，有望成为非小细胞肺癌辅助诊断、疗效评估及预后判断的参考指标。

关键词：非小细胞肺癌;外周血cfDNA总浓度;长片段DNA濃度

中图分类号：R734.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.030

文章编号：1006-1959（2019）04-0091-04

Abstract：Objective To investigate the clinical value of quantitative detection of total cfDNA concentration and long DNA concentration in peripheral blood of patients with operable non-small cell lung cancer. Methods From January to December 2017， 60 patients with operable non-small cell lung cancer in the Department of Thoracic Surgery， Chengde Central Hospital were selected as experimental group. Peripheral venous blood samples were collected 1 d before surgery， 7 d after surgery and 20 d after surgery. In the same period， 60 healthy people in the physical examination center of Chengde Central Hospital were selected as the control group. Peripheral venous blood samples were collected， and the total concentration of cfDNA and long DNA concentration in the blood of the two groups were quantitatively analyzed for statistical analysis. Results The total concentration of cfDNA in peripheral vein blood in the experimental group was significantly higher than that in the control group one day before operation，the difference was statistically significant （P<0.05），There was no significant change in the total concentration of cfDNA in the peripheral venous blood of the patients in the experimental group at 7 d after operation compared with that in the first day before operation （P>0.05），the total concentration of cfDNA in the peripheral venous blood of the patients in the experimental group was significantly lower than that in the first day of operation and 7 d after operation （P<0.05） at the 20th d after operation，The concentration of long fragment DNA in peripheral venous blood of the experimental group was higher than that of the control group 1 d before operation，the difference was statistically significant （P<0.05）.There was no significant difference in the concentration of long-segment DNA in peripheral blood of the experimental group on the 7th d after operation （P>0.05）. The long-term DNA concentration in the peripheral venous blood of the experimental group was 20 d after operation. Compared with 1 d before surgery and 7 d after operation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The total concentration of cfDNA and long-segment DNA concentration in peripheral venous blood can indirectly reflect the tumor burden of non-small cell lung cancer patients， and it is expected to be a reference index for auxiliary diagnosis， efficacy evaluation and prognosis of non-small cell lung cancer.

Key words：Non-small cell lung cancer;Total concentration of peripheral blood cfDNA;Long fragment DNA concentration

肺癌（lung cancer）已成为恶性肿瘤相关死亡的首要原因[1]，在我国公布的统计数据中：2015年肺癌发病率及死亡率均位居恶性肿瘤首位[2]，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%。外周静脉血cfDNA是指游离于人体静脉血液中的脱氧核糖核苷酸，目前已证实在健康人的血液中，cfDNA主要来自凋亡细胞，几乎不来自坏死细胞[3]，而肿瘤患者血液中的cfDNA只有小部分来自于凋亡细胞，而绝大部分来自于肿瘤细胞主动释放的DNA及肿瘤坏死溶解产生的DNA[4]。有实验研究表明，恶性肿瘤患者外周静脉血中cfDNA总浓度明显高于健康人，长片段DNA作为cfDNA中最具有代表性的检验指标，可间接反映体内肿瘤负荷的变化[5]。为此，本研究采用QPCR法定量检测非小细胞肺癌患者外周静脉血中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度，并与同期健康人群作对比，以探究其與非小细胞肺癌患者肿瘤负荷的关系。

1资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月～12月承德市中心医院胸外科收治的可手术切除的非小细胞肺癌患者60例为实验组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄（56.58±3.35）岁。本研究经我院伦理委员会审批通过，所有患者自愿加入并签署知情同意书。纳入标准：①原发性肺癌，初诊、初治、可手术切除且术前活检病理考虑为非小细胞肺癌或临床诊断为肺恶性肿瘤且经术后病理证实的患者;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况;③若手术前入实验组手术后病理证实为小细胞肺癌、转移癌及肺部良性肿物者剔除。选择同期于承德市中心医院体检中心健康体检者60例为对照组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄（54.58±2.10）岁，纳入标准：①体检后随访6个月内未发现肿瘤或癌前病变;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况。两组的排除标准：①感染性疾病的患者;②系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病的患者;③接受器官移植及血液系统疾病的患者;④脑出血、脑梗死、心肌梗死、肺栓塞的患者;⑤妊娠期患者;⑥术前行新辅助放疗、化疗、免疫治疗的患者。两组年龄、性别等基线资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），研究可比。

1.2仪器与方法 ①标本的采集：用EDTA抗凝管分别采集两组研究对象外周静脉血液10 ml;②实验血浆制备：将所采集标本放入离心机（TGL-20型）中以1600 rpm离心10 min，小心吸取淡黄色血浆上清到新的离心管中再用16000 rpm离心10 min，获得血浆样品;③血浆直接扩增模板准备：将血浆样品用Tris-EDTA缓冲液进行10倍稀释后作为血浆直接扩增模板备用。④标准品的稀释：先将Human DNA Standard（100 ng/μl）用Stock Diluent，SDB稀释5倍至浓度为20 ng/μl的Stock，再稀释20倍得到浓度为1.0 ng/μl的标准品，再将所得的标准品依次稀释4倍，共稀释6次，得到浓度由1.0 ng/μl至0.000244141 ng/μl的7个不同浓度的标准品。⑤QPCR反应体系配制及反应：根据所需要配制的孔数行反应体系配制，分别配出需要量的目的片段以及内参照Internal PCR Control（IPC）的反应体系混合物。2 μl血浆的模板DNA、2X SYBR GREEN MASTER MIX、1 mM每种dNTP、0.2 μm引物，上述为25 μl体系，不足部分用去核酸酶水补齐。引物1（总浓度，human LINE-1 family，97 bp）：正向： 5'-tggcacatatacaccatggaa-3'、反向： 5'- tgagaatgatggtttccaatttc-3'[6]。引物 2（长片段浓度，human LINE-1 family，300 bp）：正向： 5'-ACACCTATTCCAAAATTGACCAC-3'、反向：5'-TTCCCTCTACACACTGCTTTGA-3'[7]。QPCR反应程序：预变性，95℃，1 min;变性， 95℃，8 s;退火/延伸 60℃，15 s;变性，退火/延伸，35个循环，进行实时定量PCR检测。

1.3观察指标比较实验组术前1 d与对照组外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度情况;比较实验组术前1 d、术后7 d、术后20 d外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度变化情况。

1.4统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件对实验检测结果进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两个独立样本t检验，实验组手术前后不同时间段数据比较采用配对样本t检验，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组外周静脉血中cfNDA总浓度比较实验组患者术前1 d外周静脉血中cfDNA总浓度高于对照组（t=9.519，P=0.000），实验组患者术后7 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d无明显变化（t=0.161，P=0.873），实验组患者术后20 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d、术后7 d下降（t=2.594，P=0.012;t=2.668，P=0.010），见表1。

2.2两组血浆长片段DNA浓度比较实验组患者术前1 d外周静脉血中长片段DNA浓度高于对照组（t=9.366，P=0.000），实验组患者术后7 d外周静脉血中长片段DNA浓度与术前1 d无明显变化（t=0.546，P=0.587），实验组患者术后20 d外周静脉血中长片段DNA浓度较术前1 d、术后7 d下降（t=2.280，P=0.026;t=2.964，P=0.004），见表2。

3讨论

目前，非小细胞肺癌的临床常用辅助诊断方法主要有胸部CT、纤维支气管镜及血清肿瘤标记物等，胸部CT可显示病变的大小、范围及纵隔淋巴结等情况[8]，但受到扫描层厚的影响，一般很难发现直径<5 mm的肿瘤，且有辐射暴露。纤维支气管镜+组织病理学活检技术是诊断肺癌的金标准[9]，但前者对周围型肺癌的诊断率较低，有部分患者难以耐受。血清肿瘤标记物在恶性肿瘤患者的组织、体液中广泛存在[10，11]，与肺癌相关的主要有细胞角蛋白21-1（CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、鳞状细胞癌抗原（SCCA）以及癌胚抗原（CEA）[12]等，该检测具有创伤小、便捷、迅速等特点，但单个标记物的敏感性和特异性偏低，较难满足临床的需求，因此常常将几种肿瘤标记物联合检测，即使这样其敏感性和特异性仍不够理想。

在肿瘤诊疗过程中，对体内肿瘤细胞负荷量的大小及变化进行动态监测具有临床意义。美国国家癌症研究所（NCI）给出了肿瘤负荷（tumor burden，TB）的定义，即人体中癌细胞的数量、肿瘤的大小或癌症病灶的总量。有研究表明，外周静脉血中的游离DNA（cfDNA）和长片段DNA浓度可间接反映人体内TB的变化，且特异性和灵敏性较高、侵入性小、便捷、经济，可以对TB进行动态监测进而反映肿瘤的生物活性[13]。

健康人外周血游离DNA大多来源于体细胞正常的新陈代谢，而肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞，且健康人外周血游离DNA的含量较肿瘤患者的外周血游离DNA的含量低[14]。目前，国内外已有大量研究结果表明外周静脉血cfDNA总浓度与肿瘤的发生、发展具有相关性[15]，肿瘤患者cfDNA水平高于正常人，且cfDNA具有ctDNA的特征，如肿瘤相关基因的突变、微卫星改变、甲基化异常及线粒体DNA突变等[16]。已有研究表明，在直肠癌患者中，其外周血cfDNA联合血清肿瘤标志物检测，可提高直肠癌诊断的敏感性和特异性 [17，18]。对于胃癌患者，外周血cfDNA联合肿瘤标记物，可提高胃癌的诊断率，且二者联合对胃癌筛选具有临床应用价值[19]。宫頸癌患者外周血cfDNA浓度与患者临床分期的早晚、病理分级的高低、肿瘤直径的大小、血清肿瘤标记物的升高或下降趋势呈正相关，血清cfDNA水平过高则表明宫颈癌进展或预后不良[20，21]。

本研究发现，外周静脉血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度的在非小细胞肺癌患者与健康人之间存在差异，动态监测可反映其体内肿瘤负荷的变化，临床上可用于辅助非小细胞肺癌患者的诊断、治疗效果的评估及肿瘤复发的监测。非小细胞肺癌患者术前呈带瘤状态，外周血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度高于健康人，手术切除肉眼可见肿瘤后外周血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度均下降;术后7 d由于机体仍处于手术应激状态或手术后的创伤恢复期，此时检测外周静脉血中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度并不能准确的反映体内肿瘤负荷的变化，因为这一时期存在多项干扰因素，而术后20 d机体逐渐恢复，内环境趋于稳态，此时检测外周静脉血中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度受其它因素影响较小，可准确的反映体内肿瘤负荷的变化，用于评价治疗效果。

综上所述，外周血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度在非小细胞肺癌患者辅助诊断、评估疗效、监测复发转移及判断预后等方面存在一定的临床意义，有进一步研究的价值。

参考文献：

[1]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

[2]Chen W，Zheng R，PD B，et al.Cancer statistics in China 2015[J].CA cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3]Boysen AK，Wettergren Y，Sorensen BS，et al.Cell-free DNA levels and correlation to stage and outcome following treatment of locally advanced rectal cancer[J].Tumour Biol，2017，39（11）：3-4

[4]Zhang R，Shao F，Wu X，et al.Value of quantitative analysis of circulating cell free DNA as a screening tool for lung cancer：A meta-analysis[J].Lung Cancer，2016，2（21）：24-26.

[5]袁静，刘丽荣.血循环DNA的研究进展[J].贵州医药，2015（11）：1045-1047.

[6]Almodovar K，Iams WT，Meador CB，et al.Longitudinal Cell-Free DNA Analysis in Patients with Small Cell Lung Cancer Reveals Dynamic Insights into Treatment Efficacy and Disease Relapse[J].Thorac Oncol，2018，13（1）：112-123.

[7]Wei S，Grace ZQ，Zhonglin L，et al.Analysis of circulating tumor DNA of archived plasma samples[J].Joural Of Clinical Oncology，2016，34（15）.

[8]詹先进，郑大伟.CT增强扫描技术在周围型肺癌淋巴结转移的诊断研究[J].中国CT和MRI杂志，2017（10）：46-48.

[9]赵彦程，张新.支气管镜技术发展与肺癌早期诊断[J].上海医药，2018，39（7）：6-9.

[10]王平.肺癌应用血清肿瘤标记物联合检测诊断的价值分析[J].当代医学，2017，23（20）：139-141.

[11]程群英，邹春标.联合检测血清肿瘤标记物在恶性肿瘤诊断中的价值[J].现代预防医学，2015（22）：4221-4224.

[12]李艳，程小宪，柳玉花.肿瘤标记物检验在肺癌诊断中的临床价值评价[J].中国医药指南，2014，12（27）：127.

[13]丁兰，赵超，安静，等.血浆游离DNA在临床应用中的新进展[J].现代生物医学进展，2016（18）：3593-3596.

[14]丁春明，杨政权，栾菊，等.循环游离DNA检测及其临床应用进展[J].临床檢验杂志，2017，35（8）：564-569.

[15]郑照正，闵丽姗，钱福初，等.定量分析结直肠癌患者血浆循环游离DNA的临床价值[J].中华实验外科杂志，2018，35（3）：529-532.

[16]Diehl F，Schmidt K，Choti M A，et al.Cirulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J].Nat Med，2008，14（9）：985-900.

[17]郑照，闵丽姗，钱福初，等.定量分析结直肠癌患者血浆循环游离DNA的临床价值[J].中华实验外科杂志，2018，35（3）：529-532.

[18]陈亚伟，兰玲，张恒辉，等.结直肠癌患者血浆游离DNA含量与临床特征的相关性[J].胃肠病学和肝病学杂志，2017，26（6）：709-712.