川西高原野生斜茎黄芪根瘤菌的遗传多样性

江华明， 李仁全，彭万仁， 张 波，刘新春，刘松青

(1.四川职业技术学院，四川 遂宁 629000；2.成都师范学院化学与生命科学学院， 四川 成都 611130；3.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；4.四川农业大学农学院，四川 成都 611130)

【研究意义】豆科植物能通过生物固氮为土壤提供氮素，这比化学肥料更具有可持续性[1]。 根瘤菌与豆科植物建立共生关系，并把游离的氮气转化为氨供植物需要。正是由于这个原因，豆科植物能够生长在不同类型的土壤中，即使是在缺氮环境中也能正常生长。斜茎黄芪(沙打旺)野生种在我国东北、华北、西北和西南地区均有分布。斜茎黄芪根系发达，适应性强，分布广泛，是高原草原的优良牧草和治沙保土植物。其种子可入药，为强壮剂，主治神经衰弱[2]。斜茎黄芪抗逆性强，其栽培种产草量大，饲用价值高，对家畜还有一定的保健作用，是我国西部生态环境治理和发展畜牧业的优良草种。【前人研究进展】目前国内学者主要对北方地区野生斜茎黄芪根瘤菌遗传多样性进行了研究。高俊莲等对来自北方六省市95株斜茎黄芪根瘤菌菌株进行了表型性状数值分析研究，结果表明，全部供试菌株在83 %相似性水平上分为19个表观群，显示出极大的遗传多样性，同时，部分菌株表现出很强的抗逆性[3]。采用AFLP指纹图谱分析技术分析结果表明，在50 %相似性水平上，全部95个菌株被分成31个AFLP群，亦显示出极大的遗传多样性[4]。四川甘孜州位于青藏高原东部。该区域年均气温在5～10 ℃之间，年降水量在400～1000 mm之间，气候冷凉，降雨较少，昼夜温差大。【本研究切入点】本研究从四川甘孜州5县(雅江、道孚、康定、炉霍、理塘)8个采样点采集到斜茎黄芪植物根瘤 ，将分离纯化出的菌株拟通过BOX-PCR、16S rDNA-RFLP及PCA(Principal Component Analysis)来分析斜茎黄芪根瘤菌的遗传多样性；通过16SrDNA序列同源性确定菌株的系统发育地位；通过测定菌株的耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围来分析斜茎黄芪根瘤菌的抗逆性。【拟解决的关键问题】以期对我国西南地区，特别是青藏高原横断山区斜茎黄芪根瘤菌的系统进化和分类学地位提供参考。

1 材料与方法

1.1 斜茎黄芪植物根瘤的采集及其根瘤菌的分离和纯化

斜茎黄芪植物根瘤及土壤样品采集自四川甘孜州雅江、道孚、康定、炉霍、理塘等5县8个采样点，同时观察记录了所采集根瘤的形状及结瘤部位。

参照Vincent的方法[5]从斜茎黄芪植物根瘤中分离和纯化根瘤菌[6]。分离的供试菌株和参比菌株列表1。

表1 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株特性及参比菌

续表1 Continued table 1

菌株Strain宿主Host来源 (海拔)Origin (Elevation)16S rDNA序列号Accession No.Max[NaCl] (%) pH范围pH range温度(℃) Temperature range SCAU440A.adsurgensBamei, Daofu (3520 m)MK3870866 D4月11日4～37 SCAU446A.adsurgensLuoguoliang, Luhuo(3700 m)24月11日4～50 SCAU447 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387087 24月11日4～50 SCAU448 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387088 24月11日4～50 SCAU449A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38708924月10日4～50 SCAU450 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387090 24月10日4～50 SCAU451 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709124月10日4～50 SCAU452A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709224月10日4～50 SCAU453A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709324月10日4～50 SCAU456A.dsurgens Xiongba, Litang(3640 m)MK38709444月11日4～50 SCAU457A.adsurgensXiongba, LitangMK38709524月10日4～50 SCAU458A.adsurgensXiongba, LitangMK38709644月11日4～50 SCAU461A.adsurgensGaoershi, Yajiang(4100 m)44月11日4～50 M.austylicum WSM2073TBiserrula pelecinusAustraliaM. huakuii CCBAU 2609TAstragalus sinicusNanjing, ChinaR.sullae IS123THedysarum coronariumXinjiang, ChinaS.meliloti ATCC9930TMedicagosativaUSAM.septentrionale SDW014TAstragalus dsurgensLiaoning, ChinaM. temperatum SDW018TAstragalus dsurgensLiaoning, ChinaM.tianshanense CCBAU 3306TGlycyrrhiza llidifloraXinjiang, ChinaM. ciceri ATCC5158TM. amorphae ACCC 19665TCicer arietinumSpainR.leguminosarum USDA2370TAmorpha fruticosaBeijing, ChinaR.etli CFN42TR.leguminosarum 127K17Pisum sativumUSAAg. tumefaciens ATCC 23308TAg. rubi ATCC13335TPhaseolus vulgarisCNPBSPhaseolus sp.USA

注：R:Rhizobium;M:Mesorhizobium;Ag:Agrobacterium; D：Delayed growth and small colonies；4 ℃：Cultured for 30 days.

1.2 菌株生理特性分析

对30株根瘤菌分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围的测定[6]。

1.3 遗传多样性分析

1.3.1 BOX-PCR指纹分析 参照Little[7]的方法分别提取各菌株的总DNA，并在-20 ℃条件下保存备用。BOX-PCR的引物序列为:BOXAIR 5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3’[8]。具体操作方法请参见文献6。

1.3.2 16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析 选用正向引物P1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3’)和反向引物P6(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)[9]。以各菌株的总DNA为模板来扩增16S rDNA，并选用4种限制性内切酶，分别为HaeIII、MspI、HinfI和TaqI。具体操作方法请参见文献6。

1.4 斜茎黄芪根瘤菌16S rDNA系统发育分析

采用1.3.2 的反应体系和程序，分别扩增斜茎黄芪根瘤菌的16S rDNA片段，检测扩增产物(1500 bp)后送北京华大基因有限公司测定序列，用Neighbor-Joining方法构建系统发育进化树。

1.5 回接结瘤试验

取适量斜茎黄芪种子，用无菌水浸泡36 h，用75 %酒精处理5 min，再用0.1 % HgCl2处理 3 min，无菌水漂洗6次，然后浸泡6～8 h。将已表面消毒并浸泡后的种子置于已灭菌的滤纸作垫层的平板中，在2～830 ℃温箱中萌发。待种子萌发至双叶期(7～10 d)，将幼苗放在菌数为108个mL-1的菌液中处理5 min。用已灭菌的镊子取2株幼苗放置在已灭菌的滤纸与试管壁之间(试管20 mm × 200 mm，内盛无氮营养液5 mL)，每个菌株重复3个装置。将所有装置放在光照室，每天控制光照时间14 h，定期补充无氮营养液，培养30 d。观察各植株结瘤情况，统计结瘤数、瘤重。

1.6 数据分析和处理

材料间遗传相似系数(GS)的计算采用Nei[10]的方法。在GenBank 数据库中获取斜茎黄芪根瘤菌的序列号(表1)。具体方法请参见文献[6]。

2 结果与分析

2.1 斜茎黄芪根瘤菌的分离、回接和抗逆性分析

从四川甘孜州5县8个采样点(海拔高度从3190～4100 m)获得的斜茎黄芪植物根瘤中分离纯化出30个根瘤菌菌株(康定17 株，道孚1株，炉霍8株，理塘3株，雅江1株)，并进行回接结瘤，均能结瘤。同时选取了分属于Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium的14个参比菌株(表1)。

对30个菌株分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度的测定。结果表明，在 2 % NaCl的YMA培养基上，30个供试菌株均能正常生长。进一步测定实验结果显示，除9/30的菌株只能耐受 2 % NaCl外，其他菌株中，能在 4 % NaCl及以下的YMA培养基上生长的占7/30， 能在 6 % NaCl及以下的YMA培养基上生长的占9/30，有少数菌株(SCAU409, SCAU415, SCAU423, SCAU433， SCAU 434)还能在 7 % NaCl及以下的培养基上生长； 在全部供试菌株中， 6/30的菌株只能在pH 4～10的培养基上生长， 而其余 24/30的菌株都能在pH 4～11的培养基上生长；20/30的菌株能在4～50 ℃的恒温条件下生长，所有菌株能在4～37 ℃和 在60 ℃条件下处理10 min后再置28 ℃条件下生长(表1)。

2.2 遗传多样性分析

2.2.1 BOX-PCR指纹及其主成分分析 (PCA) 以各菌株总DNA为模板, BOXAIR(5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’)为引物，对30株斜茎黄芪供试菌株及14株参比菌株进行BOX-PCR，在2 %琼脂糖凝胶电泳板上得到BOX-PCR指纹图谱(图1)。

BOX-PCR聚类分析结果显示，斜茎黄芪30个供试菌株在相似系数82.4 %水平上分成6个遗传群。cluster I：SCAU406，SCAU423；cluster II：SCAU411， SCAU418， SCAU427， SCAU434；cluster III：SCAU456； SCAU458，SCAU 461；cluster IV：SCAU408，SCAU409，SCAU416，SCAU433；cluster V： SCAU447，SCAU448，SCAU449，SCAU450，SCAU451，SCAU452，SCAU453；cluster VI：SCAU412，SCAU415，SCAU417，SCAU419，SCAU440,SCAU428 and SCAU457。除SCAU436与M.septentrionaleSDW 014T；SCAU410与M.temperatumSDW 018T聚群外，其余供试菌株均未与参比菌株聚群 (图2)。

应用NTSYS-pc(V2.10e)软件对44个菌株(斜茎黄芪30个供试菌株和14个参比菌株)BOX-PCR的相似系数进行主成分分析，前3个主成分所能解释的相关性分别为19.93 %、13.72 %和11.82 %，并用EIGEN 程序作主成分之间的三维关系图(图3)。从主成分分析结果来看，30个斜茎黄芪根瘤菌的分群和BOX-PCR聚类结果基本一致。但在主成分分析结果中，SCAU 461与R.sullaeIS123聚类成群II；SCAU410与SCAU452聚类成群III；SCAU453进入群I；SCAU428与S.meliloti102F28聚成群V；SCAU440，SCAU436进入群VI并与M.tianshanenseCCBAU 3306T聚类；另外，SCAU456，SCAU458，SCAU440单独分开。

1、SCAU406；2、SCAU408；3、SCAU409；4、SCAU410；5、 SCAU411； 6、SCAU412； 7、SCAU415；8、SCAU416；9、SCAU417； 10、SCAU418；11、SCAU419；12、SCAU423；13、SCAU427；14、SCAU428；15、SCAU433；16、SCAU434；17、SCAU436；18、SCAU440；19、SCAU446；20、SCAU447；21、SCAU448；22、SCAU449；23、SCAU450；24、SCAU451；25、SCAU452；26、SCAU453；27、SCAU456；28、SCAU457；29、SCAU458；30、SCAU 461图1 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株BOX-PCR指纹图谱Fig.1 BOX-PCR fingerprints for Rhizobia in Astragalus adsurgens(M: 250 bp marker)

图2 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株及参比菌株 BOX-PCR聚类分析图Fig.2 Dendrogram based on BOX-PCR fingerprints for Rhizobia in Astragalus adsurgens Pall and reference strains

1： SCAU406；2： SCAU408；3：SCAU409；4：SCAU410；5： SCAU411； 6：SCAU412； 7：SCAU415；8：SCAU416；9：SCAU417； 10：SCAU418；11：SCAU419；12：SCAU423；13：SCAU427；14：SCAU428；15：SCAU433；16：SCAU434；17：SCAU436；18：SCAU440；19：SCAU446；20：SCAU447；21：SCAU448；22：SCAU449；23：SCAU450；24：SCAU451；25：SCAU452；26：SCAU453；27：SCAU456；28：SCAU457；29：SCAU458；30：SCAU 461；32：M. huakuii CCBAU 2609T；33: R.sullae IS123；34: S.meliloti 102F28(S.meliloti ATCC9930T); 35: M. septentrionale SDW 014T；36: M. temperatum SDW 018T；37：M.tianshanense CCBAU 3306T；38、C9：M. ciceri USDA 3378T(M. ciceri ATCC5158T)；39：R.leguminosarum USDA2370T； 40：R.etli CFN42; 41：R.leguminosarum 127K17；42：M. amorphae ACCC 19665T； 43：Ag.tumefauensIAM13129T(Ag. tumefaciens ATCC 23308T); 44：Ag. rubi IAM13569T(Ag. rubi ATCC13335T)图3 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株及参比菌株BOX-PCR主成分分析三维图Fig.3 3-d principal component analysis for BOX-PCR of strains isolated from Astragalus adsurgens and reference strains

2.2.2 16S rDNA PCR-RFLP聚类分析 聚类结果表明，在83 %的相似性水平上 ，30个斜茎黄芪根瘤菌菌株聚成3个遗传群，而SCAU457，SCAU415，SCAU418，SCAU453则单独分开(图4)。将采用UPGMA 法进行聚类分析的结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行Mantel 检验。结果表明，2 种矩阵显著相关，相关系数r=0.884 (P=0.005)，说明聚类结果能较准确地反映了菌株之间的遗传关系。

2.3 斜茎黄芪根瘤菌16S rDNA系统发育分析

对30个斜茎黄芪供试菌株进行BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA的综合分析后，选择其中22个代表菌株的 16S rDNA 扩增产物送北京华大基因科技股份有限公司进行测序后建系统发育树(图5)。结果表明， 22个代表菌株在系统发育树状图中分成4个遗传群：SCAU406、SCAU461、SCAU427、SCAU423、SCAU458、SCAU456、SCAU428、SCAU410、SCAU436等9个菌株与Rhizobium-Agrobacterium聚群，其中，SCAU428与Rhizobiumsp. CCBAU 65810的相似度为99 %，SCAU436与RhizobiumLMG 23643的相似度为96 %；SCAU447、SCAU448、 SCAU449、SCAU450、SCAU451、SCAU452与Rhizobium聚群，其中，SCAU451与Rhizobiumsp. CCBAU 41184的相似度为88 %(最高)，而与Rhizobiumsp. USDA 1920的相似度为85 %；SCA457与MesorhizobiumlotiATCC 700743T(X67229)聚群但相似度低，与MesorhizobiumlotiNZP2037的相似度(最高)为98 %；其余菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均与OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群，显示出这7株供试菌株与14个参比菌株(无Ochrobactrum参比菌株)均存在一定的差异。这与供试菌株16S rDNA PCR-RFLP聚类结果基本一致。其中，SCAU412与OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度为97 %，SCAU416与OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度为96 %。 供试菌株16S rDNA序列与已知菌株较低的相似度预示可能存在潜在的新种。

图4 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株及参比菌株16S rDNA PCR-RFLP聚类Fig.4 Dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP of the strains isolated from Astragalus adsurgens Pall and reference strains

3 讨 论

本研究通过BOX-PCR、16S rDNA-RFLP及PCA(Principal Component Analysis)、16S rDNA序列同源性分析对川西高原地区野生斜茎黄芪根瘤菌的遗传多样性和系统发育关系进行了系列研究。结果表明，川西高原地区(四川甘孜藏族自治州)野生斜茎黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。30个菌株分别属于Rhizobium(11/30 strains)，Ochrobactrum(9/30 strains)，Mesorhizobium(1/30 strains) 和Rhizobium-Agrobacterium(9/30 strains)。斜茎黄芪根瘤菌16S rDNA Simpson遗传多样性指数D=0.954。

本研究采集的斜茎黄芪根瘤来自海拔3190～4100 m的高寒环境，土壤含水率多为26.14 %～34.38 %之间，环境条件特殊。通过对30个斜茎黄芪供试菌株分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度的测定的结果(表1)显示，在 2 % NaCl的YMA培养基上，30个供试菌株均能正常生长。其中，能在 4 % NaCl的YMA培养基上生长的占8/30， 能在 6 % NaCl的YMA培养基上生长的占9/30，另外，尚有少数菌株(SCAU409，SCAU415，SCAU423，SCAU433，SCAU434)能在 7 % NaCl的培养基上生长。盐分是影响微生物生长的最重要的环境胁迫因素之一。高寒地区斜茎黄芪根瘤菌大多数都具有较强的耐盐性，这很可能是特殊的生态环境条件促使根瘤菌产生了积极的适应机制，如积累胞内相溶溶质谷氨酸和海藻糖来抵抗高盐危害[11]这些菌株是宝贵的耐盐根瘤菌资源，对改良盐碱土壤有着积极的意义。 在全部供试菌株中，6/30的菌株能在pH 4～10的培养基上生长，而 24/30的菌株能在pH 4～11的培养基上生长；20/30的菌株能在4～50 ℃的恒温条件下生长，所有菌株能在4～7 ℃和 在60 ℃条件下处理10 min后再置28 ℃条件下生长。进一步表明川西高原地区野生斜茎黄芪根瘤菌具有较强的适应高寒环境(温差大，酸碱变化幅度大)的能力。

The tree was constructed by neighbor-joining(NJ) using the Kimura2-parameter model available in the MEGA4.0s of tware, based on the sequences of actinomycetes partial 16S rDNA gene and the reference strains. The scale bar corresponds to 0.01 substitutions per nucleotide position. Number in parentheses represent the sequence accession numbers in GenBank图5 斜茎黄芪根瘤菌供试菌株16S rDNA系统发育图Fig.5 Phylogenetic tree analysis of 16S rDNA of the strains isolated from Astragalus adsurgens Pall

16S rDNA-RFLP和BOX-PCR是遗传学分析中常用的2种方法，均能有效揭示供试生物的遗传多样性，但两种方法相比较而言，16S rDNA-RFLP分析是利用限制性酶切图谱类型，简便快速，常用来进行根瘤菌种内遗传多样性和种间系统发育关系研究[12]； 而BOX-PCR是利用根瘤菌基因组中存在的重复序列来反映菌株间的遗传差异，遗传类型往往具有菌株的特异性[13]。 本研究中，在83 %的相似性水平上，30个斜茎黄芪根瘤菌菌株在16S rDNA PCR-RFLP聚类分析中聚成3个遗传群，而BOX-PCR聚类分析结果显示，斜茎黄芪30个供试菌株在相似系数82.4 %水平上分成6个遗传群，且除SCAU436与M.septentrionaleSDW 014T；SCAU410与M.temperatumSDW 018T聚群外，其余供试菌株均未与参比菌株聚群。应用NTSYS-pc(V2.10e)软件对44个菌株(斜茎黄芪30个供试菌株和14个参比菌株)BOX-PCR的相似系数进行主成分分析，前3 个主成分所能解释的相关性分别为19.93 %、13.72 %和11.82 %，并用EIGEN 程序作主成分之间的三维关系图。结果表明，30个供试菌株的主成分分析和BOX-PCR聚类分析结果基本上一致。但在主成分分析结果中，SCAU 461与R.sullaeIS123聚类成群II，SCAU410与SCAU452聚类成群III，SCAU453进入群I；SCAU428与S.meliloti102F28聚成群V；SCAU440，SCAU436进入群VI并与M.tianshanenseCCBAU 3306T聚类，另外，SCAU456，SCAU458，SCAU440单独分开。这表明，无论是通过16S rDNA-RFLP分析还是BOX-PCR，大部分斜茎黄芪供试菌株与已知菌株均有较大的遗传差异性，均揭示出川西高原地区野生斜茎黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。

22个代表菌株在16S rDNA系统发育树状图中分成4个遗传群：SCAU406、SCAU461、SCAU427、SCAU423、SCAU458、SCAU456、SCAU428、SCAU410、SCAU436等9个菌株与Rhizobium-Agrobacterium聚群，其中，SCAU428与Rhizobiumsp. CCBAU 65810的相似度为99 %，SCAU436与RhizobiumLMG 23643的相似度为96 %；SCAU447、SCAU448、 SCAU449、SCAU450、SCAU451、SCAU452与Rhizobium聚群，其中，SCAU451与Rhizobiumsp. CCBAU 41184的相似度为(最高)88 %，而与Rhizobiumsp. strain USDA 1920的相似度为85 %；SCA457与MesorhizobiumlotiATCC 700743T(X67229)聚群但相似度低，与Mesorhizobiumloti NZP2037的相似度(最高)为98 %；其余菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均与OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群，显示出这7株供试菌株的遗传性与14个参比菌株(无Ochrobactrum属参比菌株)均存在较大的差异。这与供试菌株16S rDNA PCR-RFLP聚类结果基本一致。属于Rhizobium和Mesorhizobium的多个斜茎黄芪根瘤菌供试菌株的16S rDNA序列与已知菌株较低的相似度预示着可能存在潜在的新种[14]。这尚需做进一步的功能基因分析。

在已知的研究文献[3-4]中，斜茎黄芪根瘤菌均属于Rhizobium和Mesorhizobium。本研究中，30个菌株分属4个属。其中，首次分离得到9个属于Ochrobactrum的菌株。回接试验表明，所选菌株SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433能够结瘤(但瘤较小)。16S rDNA序列分析中，菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均与OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群。其中，SCAU412与OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度最高，为97 %，SCAU416与OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度为96 %。因此，SCAU412或SCAU416有可能为Ochrobactrum的一个潜在的新种[14]。

本研究分离纯化获得的斜茎黄芪根瘤菌能为高寒地区特殊生境优良菌株的筛选提供种质资源，所作分析能对我国西南地区，特别是青藏高原横断山区斜茎黄芪根瘤菌的系统进化和分类学地位提供一些参考。

4 结 论

川西高原地区(四川甘孜藏族自治州)野生斜茎黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性，大多数菌株对高盐、高温、低温及过酸过碱环境均具有很强的耐受能力。

通过遗传学分析发现，在斜茎黄芪根瘤菌供试菌株中可能存在一些新种，因此，需要进一步进行功能基因分析加以确认，以期能丰富根瘤菌物种资源库， 为该区域的生态恢复与重建提供优良根瘤菌资源。