滇重楼野生品种与栽培品种核苷类成分质量等同性研究

孟 莹，王 骞,，周 浓，杨 敏，母茂君,，黄 瑜，田朝敬，李 杨

(1.大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120；3.三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120；4.大理大学学报编辑部，云南 大理 671003)

【研究意义】滇重楼为百合科重楼属云南重楼的干燥根茎，是中药重楼的重要来源之一[1]。具有清热解毒、消肿止痛等功效，现代药理学研究表明，重楼具有抗肿瘤、抗菌、抗炎和止血等作用[2]。重楼含有丰富的化学物质，主要包括甾体皂苷类、黄酮类和核苷类等[3]。核苷是一类由含氮碱基与糖缩合而成的糖苷，是构成生命体DNA和RNA的基本物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗血小板聚集等作用[4]，与重楼的生物活性具有一定的相关性，可作为重楼药材质量评价的重要指标。近年来，重楼药材应用范围不断扩大，市场需求量逐年增加，供需矛盾日益突出[5]，仅靠自然资源已无法满足市场需求，现阶段种苗栽培技术日益成熟[6]，重楼仿野生种植规模不断扩大，但栽培重楼与野生重楼是否具有质量等同性尚无确切结论。【前人研究进展】周浓等[7]测定重楼属植物中10种核苷和碱基，结果表明，核苷和碱基类成分的含量及组成结构比存在着较大差异，产地和品种是造成差异的主要因素。潘兴娇等[8]测定云南重楼根茎中9种核苷类成分的含量。结果表明，重楼核苷含量受产地、环境因素影响较大，品质表现出一定的地域和生境依赖性。【本研究切入点】本实验采用HPLC法对16批野生品种和17批栽培品种的9种核苷含量进行测定，通过聚类分析和主成分分析方法对其进行评价，以期全面、客观评价栽培重楼的品质。【拟解决的关键问题】以9种核苷成分含量为指标，对不同产地样品进行质量评价，探讨栽培重楼是否与野生重楼具有质量等同性，为扩大药用资源提供科学依据。

表1 样品来源信息

1 材料与方法

1.1 供试材料

高效液相色谱仪(日本岛津集团)；多管架自动平衡离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；分析天平(德国Sartorius公司)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥99 %。甲醇为色谱纯(德国默克公司)、水为娃哈哈纯净水。野生组样品为课题组成员在相应地点采挖所得；栽培组样品为野生滇重楼苗移栽至相应生境下，经过土壤杀虫、杀菌处理，施基肥、浇透定根水、喷施叶面肥等方法进行栽培后采挖所得，所有样品经重庆三峡学院周浓教授鉴定为百合科重楼属植物云南重楼[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]。留样凭证存放于三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室(重庆三峡学院)。样品来源信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Venusil MP C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～10 min，1 %～5 % A；10～15 min，5 %～15 % A；15～22 min，15 %～17 % A；22～26 min，17 %～20 % A；26～32 min，20 %～24 % A；32～50 min，24 %～1 % A；50～55 min，1 % A)。检测波长：260 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μl；柱温：35 ℃。

1.2.2 核苷对照品溶液的配制 分别精密称取减压干燥至恒重的尿嘧啶5.1 mg、胞苷6.4 mg、鸟嘌呤6.1 mg、尿苷31.7 mg、腺嘌呤6.2 mg、鸟苷9.8 mg、胸苷6.4 mg、腺苷57.2 mg、2′-脱氧腺苷5.1 mg，置于同一容量瓶中，加水、混匀、定容至10 mL，即得混合核苷对照品母液，其浓度分别为尿嘧啶0.51 mg/mL、胞苷0.64 mg/mL、鸟嘌呤0.61 mg/mL、尿苷3.17 mg/mL、腺嘌呤0.62 mg/mL、鸟苷0.98 mg/mL、胸苷0.64 mg/mL、腺苷5.72 mg/mL，2′-脱氧腺苷0.51 mg/mL。

1.2.3 滇重楼供试溶液的配制 精密称取滇重楼粉末(过三号筛)1.0 g，置于10 mL离心管中，精密加水5 mL，混匀，在室温条件下超声(300 W，40 kHz)提取15 min，取出后以4000 r/min离心10 min，吸取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤即得。

1.2.4 线性关系考察 精密量取1.2.2所得混合核苷对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，加水定容至10 mL，得到6个浓度梯度的混合核苷对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，其线性范围见表2，分别在1.2.1色谱条件下进行测定，以各对照品峰面积(Y)与其相应浓度(X)进行线性回归，线性关系考察结果见表2。

1.2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液，在1.2.1色谱条件下连续进样6次，记录各核苷的色谱峰面积，结果显示各核苷的峰面积RSD分别为1.40 %(尿嘧啶)、2.25 %(胞苷)、1.26 %(鸟嘌呤)、2.35 %(尿苷)、2.67 %(腺嘌呤)、2.89 %(鸟苷)、2.44 %(胸苷)、2.91 %(腺苷)、2.83 %(2′-脱氧腺苷)，表明仪器精密度良好。

1.2.6 重复性试验 取滇重楼粉末(样品Z 17)6份，精密称定每份1.0 g，按1.2.3方法制备供试品溶液，在1.2.1色谱条件下进行测定，记录各核苷的色谱峰面积，结果显示各核苷的峰面积RSD分别为2.20 %(尿嘧啶)、2.20 %(胞苷)、1.11 %(鸟嘌呤)、2.88 %(尿苷)、2.80 %(腺嘌呤)、2.91 %(鸟苷)、1.04 %(胸苷)、1.01 %(腺苷)、2.96 %(2′-脱氧腺苷)，表明方法重复性良好。

表2 线性关系考察结果

1.2.7 稳定性试验 将滇重楼粉末(样品Z17)供试液在室温条件下密闭放置，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，记录各核苷的色谱峰面积，结果显示各核苷的峰面积RSD分别为2.42 %(尿嘧啶)、2.45 %(胞苷)、2.50 %(鸟嘌呤)、2.43 %(尿苷)、2.51 %(腺嘌呤)、2.97 %(鸟苷)、2.88 %(胸苷)、3.00 %(腺苷)、2.72 %(2′-脱氧腺苷)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

1.2.8 加样回收率试验 取已知含量的滇重楼粉末(样品Z17)6份，精密称定每份0.5 g，分别精密加入适量各核苷对照品溶液，按1.2.3方法制备供试品溶液，在1.2.1色谱条件下进样，加样回收率分别为0.97 %(尿嘧啶)、0.99 %(胞苷)、0.99 %(鸟嘌呤)、0.95 %(尿苷)、1.01 %(腺嘌呤)、1.04 %(鸟苷)、1.02 %(胸苷)、1.01 %(腺苷)、1.00 %(2′-脱氧腺苷)，RSD均小于3.00 %，表明上述实验方法准确度较高。

2 结果与分析

2.1 核苷类成分色谱图

按1.2.1色谱条件进行分析，所得到的色谱图如图1所示。9种核苷成分分离度较好，其中图1A为按1.2.2方法制备的混合核苷对照品色谱图，图1B为按1.2.3方法制备的野生品种色谱图，图1C为按1.2.3方法制备的栽培品种色谱图。HPLC色谱分析结果表明，野生品种、栽培品种中所含核苷类成分与核苷对照品组成相同，保留时间一致。

1：尿嘧啶；2：胞苷；3：鸟嘌呤；4：尿苷；5：腺嘌呤；6：鸟苷；7：胸苷；8：腺苷；9：2′-脱氧腺苷1: Uracil; 2: Cytosine; 3: Guanine; 4: Uridine; 5: Adenine; 6: Guanosine; 7: Thymidine; 8: Adenosine; 9: 2 ′-Deoxyadenosine图1 滇重楼HPLC图Fig.1 HPLC Spectrums of Paris polyphylla

2.2 样品核苷类成分含量

按1.2.3方法制备33批滇重楼根茎的供试品溶液，其中16批为野生品种，17批为栽培品种，平行3份，在1.2.1色谱条件下进行测定，计算滇重楼根茎中9种核苷类成分的含量，结果见表3。从表3可知，野生品种各核苷类成分含量为尿嘧啶0.151(Y16)～1.557 mg/g(Y3)，胞苷0.400(Y10)～1.747 mg/g(Y9),鸟嘌呤1.045(Y8)～5.528 mg/g(Y5)，尿苷1.138(Y3)～5.284 mg/g(Y5)，腺嘌呤0.401(Y8)～2.259 mg/g(Y10)，鸟苷0.728(Y16)～4.104 mg/g(Y2)，胸苷1.017(Y2)～4.650 mg/g(Y5)，腺苷1.170(Y11)～4.860 mg/g(Y6)，2′-脱氧腺苷0.415(Y11)～2.213 mg/g(Y6)；栽培品种各核苷类成分含量为尿嘧啶0.252(Z25)～2.461 mg/g(Z18)，胞苷0.153(Z23)～1.492 mg/g(Z21)，鸟嘌呤0.839(Z31)～4.140 mg/g(Z24)，尿苷1.115(Z23)～4.935 mg/g(Z30)，腺嘌呤0.538(Z31)～1.950 mg/g(Z24)，鸟苷1.028(Z23)～4.514 mg/g(Z21)，胸苷0.311(Z23)～2.760 mg/g(Z17)，腺苷0.775(Z23)～6.103 mg/g(Z21)，2′-脱氧腺苷0.161(Z25)～1.278 mg/g(Z21)。

2.3 样品核苷类成分t检验

采用软件SPSS 22.0对全部样品进行独立样本t检验分析见表4。通过分析可知野生品种与栽培品种滇重楼中胞苷、胸苷、2′-脱氧腺苷含量有显著性差异(Sig.<0.05)，而尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷含量差异无显著性(Sig.>0.05)。

2.4 野生样品与栽培样品聚类分析

以9种核苷成分为依据，采用SPSS 22.0软件对33批滇重楼样品进行聚类分析(图2)。结果显示，33批样品可被分为2大类：第Ⅰ类：Y10、Y5、Z18、Z24和Y7；第Ⅱ类：Z21、Y14、Z22、Z33、Z30、Y9、Y6、Y11、Z17、Y3、Y1、Y12、Y16、Y15、Y8、Y13、Y4、Z23、Z31、Z20、Z26、Z25、Z32、Z28、Z27、Y2、Z29和Z19。结果显示，野生品种和栽培品种之间相互交叉，滇重楼野生品种和栽培品种无生境依赖性，生长环境不是影响核苷类成分含量的因素。

2.5 野生样品与栽培样品主成分分析

采用SIMCA-P13.0和SPSS 22.0软件对33批滇重楼样品进行主成分分析(图3)。结果显示，在所有主成分构成中，信息主要集中在前3个主成分中，其贡献率分别为42.15 %，25.94 %和12.78 %，累积贡献率为80.87 %。故选定前3个主成分来概括33批样品核苷类含量的信息。对主成分1贡献较大的是鸟苷、鸟嘌呤和尿苷；对主成分2贡献较大的是尿嘧啶和腺嘌呤；对主成分3贡献最大的是2′-脱氧腺苷。分别对3个主成分进行得分计算并排序，主成分1得分最高的是Y5，为4.945；主成分2得分最高的是Z18，为3.622；主成分3得分最高的是Y2，为2.034；综合得分最高的样品是Y5，为3.113。根据PCA分析图可知，野生组样品和栽培组样品混合分布，无法进行有效区分。

表3 样品中9种核苷类的含量

续表3 Continued table 3

分组Grouping样品编号Sample number尿嘧啶Uracil胞苷Cytosine鸟嘌呤Guanine尿苷Uridine腺嘌呤Adenine鸟苷Guanosine胸苷Thymidine腺苷Adenosine2′-脱氧腺苷2 ′-Deoxyadenosine总计(mg/g)TotalZ260.388±0.0080.270±0.0801.014±0.0422.929±0.0610.621±0.0831.094±0.0080.595±0.0181.866±0.0100.324±0.0469.101Z270.810±0.0520.538±0.0041.459±0.0383.175±0.1791.212±0.1022.475±0.0261.573±0.0482.461±0.0270.379±0.04914.082Z280.444±0.0360.438±0.0430.889±0.0382.451±0.0291.137±0.0252.243±0.0330.952±0.0742.439±0.0770.436±0.01111.429Z290.373±0.0210.395±0.0310.908±0.0364.604±0.0650.735±0.1302.692±0.1390.723±0.0442.929±0.0200.404±0.04513.763Z300.641±0.0600.955±0.0523.171±0.0894.935±0.0990.851±0.0342.612±0.0441.063±0.0235.788±0.0300.672±0.08120.688Z310.267±0.0420.952±0.0360.839±0.0652.421±0.1450.538±0.0331.726±0.0530.492±0.0202.708±0.0360.238±0.00710.181Z320.532±0.0550.527±0.0241.356±0.0732.872±0.0580.565±0.0112.078±0.1611.343±0.0593.280±0.0510.637±0.06713.190Z330.461±0.0100.923±0.0792.731±0.1204.182±0.1910.936±0.0792.680±0.0961.070±0.0535.025±0.0840.744±0.11518.752平均值0.7230.6741.9113.2070.9672.3621.2373.0180.54814.647

表4 野生与栽培滇重楼独立样品t检验

3 讨 论

通过测定滇重楼野生品种和栽培品种的核苷类成分可知，33批样品中均含有尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2′-脱氧腺苷这9种核苷，说明野生与栽培滇重楼根茎中的核苷类成分较为相似。对33批样品进行含量测定和独立样本t检验，结果表明不同产地的滇重楼的核苷含量不同。贵州省和云南省栽培品种的核苷总量较野生品种的核苷总量稍低，但差异无统计学意义，这可能与培育技术、种植模式等有关；四川省栽培品种的核苷总量是野生品种的2.377倍，这可能与四川产地栽培品种和野生品种批次较少、生长环境有关，有待于进一步收集实验材料进行研究。成分含量结果表明，野生品种与栽培品种的胞苷、胸苷、2′-脱氧腺苷含量差异具有统计学意义，其他6种核苷的含量差异无统计学意义，在一定程度上说明野生品种和栽培品种在化学成分种类和化学成分含量上均表现出一定的相似性。

图2 野生品种与栽培品种聚类分析Fig.2 Cluster analysis of wild and cultivated varieties

R2×[1]=0.4 R2×[2]=0.252 Ellipse:Hotelling’s T2(95 %)图3 野生品种与栽培品种主成分分析Fig.3 PCA of wild and cultivated varieties

通过多元统计学聚类分析和主成分分析均显示野生滇重楼和栽培滇重楼无法有效地区分，提示二者无显著性差异，詹晓如等[9]利用分光光度法测定七叶一枝花野生品种与移栽品种薯蓣皂苷元含量，同样得出二者无明显差别的结论。栽培在一定程度上保留了野生环境下的物种信息，并可有效地缩短入药年限，栽培后可以更好地按照规范化种植标准进行田间管理，进而有效地保证重楼药材的质量，从根本上解决药材质量差、资源濒危和生态环境恶化等问题，以实现生态环境保护、资源再生和综合利用及中药材生产。因此，课题组认为栽培滇重楼可以作为野生滇重楼的替代资源使用，具有质量等同性。

4 结 论

野生滇重楼和栽培滇重楼的核苷类成分含量无明显差异，栽培滇重楼可作为野生滇重楼的替代资源使用。