p53及p16在皮肤鳞状细胞癌和鲍温病中的表达及意义

邹爱玲，石年，石娴，解翠林，顾磊，陈用军，牛彬

[鄂东医疗集团市中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北黄石435000]

皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）好发于老年人的日光暴露部位皮肤（如头面部、颈背部等）。长期慢性紫外线照射被认为是主要的致癌风险因素。而且CSCC在人群中的发病率越来越高，更严重的是其转移率在某些人群中高达10%[1]。因此了解参与皮肤癌发生及发展的基因与分子学机制显然非常有必要性。事实上其发病机制尚不十分明确，到目前为止只有部分基因分子异常表达被人们所认识。由紫外线引起的p53肿瘤抑制基因突变失活，就是1个典型的例子。另外还有细胞周期抑制剂p16蛋白也常在皮肤癌中异常表达[2]。因此本研究将鲍温病（BD）和CSCC分别作为早期和晚期恶性肿瘤的代表，然后用免疫组化染色方法比较p53及p16蛋白在BD、CSCC及正常皮肤组织中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 组织标本 收集的50例CSCC和30例BD标本，来自2017年1月—2018年1月鄂东医疗集团黄石市中心医院皮肤科门诊或住院部手术切除的石蜡包埋组织，并经病理学确诊。CSCC病理表现为不规则的鳞状细胞浸润性生长，侵入真皮较深的地方，癌团主要由异型鳞状细胞或间变的鳞状细胞组成，分化好的可有角珠及角化不良细胞，分化差的常有较多的不典型核分裂相，无角珠及角化不良细胞[3]。根据角化程度又可把肿瘤分为高分化和中低分化，高分化的特点是鳞状上皮容易辨认，且常有明显的角化，上皮呈清晰的鳞状，细胞间桥明显。中低分化的特点是肿瘤结构紊乱，鳞状上皮分化不很清晰，核和胞浆显著多形性，核丝分裂明显[4]。BD病理表现为表皮全层可见不典型角质形成细胞，见多数核分裂相，细胞排列紊乱，有时可见瘤巨细胞[5]。50例CSCC患者中，男26例，女24例，年龄50～89岁，平均（68.66±9.84）岁；30岁例 BD 患者中，男 13例，女 17例，年龄 35～88岁，平均（47.64±11.45）岁。所有病例均是未经激光、放疗、化疗等抗肿瘤治疗的原发病例。20例正常皮肤组织标本来自色素痣手术切除边缘正常皮肤。

1.2 主要试剂 鼠抗人p16单克隆抗体和鼠抗人p53单克隆抗体均为即用型抗体，购自中山金桥公司产品，HRP标记山羊抗小鼠二抗为阿斯本生物公司提供。

1.3 实验步骤 采用免疫组化SP法，严格按说明书操作。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。

1.4 结果判断 由阳性细胞数量百分比和显色程度2项指标来判定结果，具体如下：阳性细胞数量在观察的同类细胞中所占比例，分为5类：阴性为0分；阳性细胞数≤10%，1分；11%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。显色程度判断阳性强度，分为4级：无着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。最终结果由两类计分分值的乘积表示：分数≥4分为阳性，＜4分为阴性[6]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料以频数表示，进行卡方检验，不符合条件者采用Fisher检验，二者相关性分析采用Spearman秩相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53蛋白染色阳性细胞特点 p53蛋白阳性表达于细胞核，阳性着色呈淡黄色至棕褐色。正常皮肤组织，p53染色多为阴性，阳性细胞主要散在分布于表皮及皮脂腺周围，以弱阳性为主。BD的阳性细胞，主要集中分布于表皮全层，细胞染色强度强。CSCC的阳性细胞，主要分布于癌巢组织内，细胞染色强度较强，见图1。

2.2 p16蛋白染色阳性细胞特点 p16蛋白阳性表达于细胞核和细胞质，阳性着色呈淡黄色至棕褐色。正常皮肤组织染色均为阴性。BD的阳性细胞，主要集中分布于表皮全层，细胞染色强度强。CSCC，p16染色多为阴性，若阳性表达，阳性细胞主要分布于癌巢周围，中央染色较弱，见图2。

2.3 p53与p16蛋白在CSCC及BD中染色情况的比较 p53与p16存在4种不同表达模式：p53-/p16-、p53-/Pp16+、p53+/p16-、p53+/p16+。30 例 BD中，p53-/p16-12 例，p53-/p16+7 例，p53+/p16-2例，p53+/p16+9例。50例CSCC中，p53-/p16-3例，p53-/p16+7例，p53+/p16-36例，p53+/p16+4例，见图 3、4。

图1 p53免疫组化染色

图2 p16免疫组化染色

图3 BD p53-/p16+表达模式

2.4 正常皮肤组织、BD及CSCC中p53蛋白的表达情况 p53蛋白在正常皮肤组织、BD及CSCC中表达的阳性率分别10.00%、36.67%及80.00%，p53蛋白在高分化鳞癌和中低分化鳞癌中表达的阳性率分别为 76.67%和 85.00%，p53蛋白在 BD和CSCC中表达阳性率均高于正常皮肤组织（P＜0.05）。p53蛋白在BD中表达阳性率低于CSCC，二者间差异有显著统计学意义（P＜0.001）。p53蛋白在BD、高分化鳞癌及中低分化鳞癌中的表达率呈上升趋势，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表 1、2。

2.5 正常皮肤组织、BD及CSCC中p16蛋白的表达情况 p16蛋白在正常皮肤组织、BD及CSCC中表达的阳性率分别为0.00%、53.33%及22.00%，在高分化鳞癌和中低分化鳞癌中表达的阳性率分别为30%和10%。p16蛋白在BD和CSCC中表达阳性率均高于正常皮肤组织（P＜0.05）。p16蛋白在BD中表达阳性率高于CSCC，二者间差异有统计学意义（P＜0.05）。p16蛋白在BD、高分化鳞癌、中低分化鳞癌中的表达阳性率呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3、4。

2.6 BD中p53和p16蛋白表达之间的关系 30例BD 中，p53-/p16-12例，p53-/p16+7例，p53+/p16-2例，p53+/p16+9例，采用Spearman秩相关分析，rs=0.402，P＜0.05，差异有统计学意义，提示BD中p53和p16蛋白的表达呈正相关性，见表5。

2.7 CSCC中p53和p16蛋白表达之间的关系 50例CSCC中，p53-/p16-3例，p53-/p16+7例，p53+/p16-36例，p53+/p16+4例，采用Spearman秩相关分析，rs=-0.579，P＜0.001，差异有统计学意义，提示 CSCC中p53和p16蛋白的表达呈负相关性，见表6。

图4 CSCC p53/p16表达模式（免疫组化染色）

表1 正常皮肤组织、BD及CSCC中p53的表达 例

表2 BD及高、中低分化CSCC中p53的表达 例

表3 正常皮肤组织、BD及CSCC中p16的表达

表4 BD及高、中低分化CSCC中p16的表达 例

表5 BD中p53和p16蛋白表达的相关性分析

表6 CSCC中p53和p16蛋白表达的相关性分析

3 讨论

CSCC是仅次于基底细胞癌第2常见的皮肤恶性肿瘤，而其发生转移及死亡的风险远高于基底细胞癌[7]。BD是一种表皮内CSCC，故又称为原位CSCC癌，其临床与病理学特征类似于CSCC。本病进展缓慢，绝大多数终生保持其原位癌状态，据报道约有3%～5%演变成侵袭性CSCC[8-9]。CSCC的发生、发展是一个极其复杂的过程，多个基因和多种分子水平共同作用的结果。原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活是导致肿瘤发生的一个重要事件。p53基因突变失活发生于50%～90%的人类恶性肿瘤包括皮肤癌。同时p16基因的失活（缺失、突变或甲基化）在人类大多数肿瘤中也被观察到[10]。本文比较了p53和p16蛋白在CSCC及BD中表达的差异性，并探讨了二者在CSCC及BD中的关系。

p53肿瘤抑制蛋白是细胞周期调控机制的重要转录因子，p53基因在维持人类基因组完整性方面的关键作用是显而易见的，因为p53基因是人类癌症中最常见的突变基因，其失活被认为是人类癌症发生的关键事件。在正常组织中，p53基因能够快速修复紫外线和致癌刺激物损伤的DNA。p53基因的突变导致p53功能的丧失，损伤的细胞积累、遗传，并表现出明显的遗传不稳定性，最终可发展为恶性肿瘤[11]。在人角质形成细胞中，正常功能的p53基因保护其不受紫外线辐射引起的基因毒性损伤。p53基因的突变可能会破坏p53的功能，允许由紫外线引起DNA受损的突变细胞积累，这导致p53突变的角质形成细胞克隆性增生，从而可以积累多个突变。因此，这种克隆性增生被认为是表皮癌变发生的关键步骤[12]。p53一直是皮肤癌发病机制研究一个热点问题，多数研究表明p53在CSCC中的表达是升高的，特别是曝光部位CSCC。2003年Blokx等[13]关于肾移植和免疫功能正常表皮癌中p53和p16表达的研究中报道，p53在CSCC中的表达与肿瘤分级相关，随着肿瘤分级的下降而增加。2007年Barzilai等[14]研究发现p53在日光性角化病、CSCC（日光暴露部位）中高表达，而在正常皮肤、日光性弹力组织变性及CSCC（非日光暴露部位）中低表达，但在CSCC中的表达与肿瘤的分化程度无关。类似的研究还有，2004年Hussein等[15]研究认为p53在正常皮肤、非肿瘤、癌前病变及皮肤肿瘤（包括原位癌及浸润性CSCC）中的表达呈逐渐上升趋势。2016年Bedir等[7]还研究了p53与p16在高分化CSCC及角化棘皮瘤中二者表达的情况，p53与p16在高分化CSCC中的表达均高于角化棘皮瘤。本文的实验结果显示p53蛋白在BD和CSCC中的表达均高于正常皮肤，p53蛋白在CSCC中高表达，且随着肿瘤分化程度的下降而增加。本实验结果与大多数研究基本一致。本研究提示p53在BD和CSCC中过度表达或上调，且其表达水平与肿瘤分化程度呈负相关，即肿瘤分化越差，表达越高。从而表明p53的高表达可能在BD及CSCC的发生、发展及浸润中发挥着重要的作用。

p16 是由 INK4a（也称为 MTSI，CDK4I，或CDKN2）基因在9p21染色体上编码的一种肿瘤抑制蛋白，通过抑制D型周期素依赖性激酶4和6，参与调控视网膜母细胞瘤基因（Rb）活性而起作用。p16CDK4/6复合物的形成使Rb能够抑制细胞周期，而复合物的形成失败使细胞分裂得以继续。因此，p16功能或结构丧失可能导致潜在受损的细胞继续增殖和肿瘤发展的风险。p16蛋白在人角质形成细胞中的表达是在低、高剂量的中波紫外线B（UVB）照射下诱导的。这也许可以解释为什么过度暴露在阳光下是一个风险因素，如脂溢性角化病、光化性角化病和CSCC，已被免疫组织化学证实了p16的表达增加[16]。近些年研究表明p16高表达是HPV相关性宫颈癌的生物标记物[17]。2006年Willman等[18]发现p16在BD中高表达。2010年Langendijk等[19]也发现p16在人头颈CSCC中高表达。2016年Marinescu等[10]研究结果显示p16在CSCC及BD中的表达明显高于上皮内瘤变，且p16表达与肿瘤分期有关，而与肿瘤分化程度无关。然而文献中p16的表达是有争议的。2002年Hodges等[20]研究结果表明大多数日光性角化症及BD均表达p16，但仅有30% CSCC表达p16。2003年Salama等[21]发现p16在BD中高表达，而在日光性角化症的表达很少，在CSCC的表达为阴性。2007年Burnwortha等[1]研究结果表明p16在日光性角化症中高表达，而在CSCC中低表达或缺失。2016年Supsavhad等[22]报道p16在猫口腔CSCC中低表达，而不同于人类头颈CSCC。2006年Conscience等[23]认为p16表达与皮肤肿瘤的组织学类型无关，而与是否发生在曝光部位有关，日光暴露部位的皮肤癌过表达（68%），非日光暴露部位皮肤癌低表达（23%）。本实验结果显示p16蛋白在BD和CSCC中的表达均高于正常皮肤，但p16在CSCC的表达（22%）比BD的表达（53.33%）低，且随着肿瘤分化程度的下降而减少。本实验结果中CSCC的p16表达较低，可能与Conscience等[23]研究的皮肤癌发生在非曝光部位有关，其表达水平与肿瘤的分化程度呈正相关，与Marinescu等[10]的研究不一致，可能是因为本实验未对皮肤癌进行分期，且分级不够详细。本研究提示p16在CSCC中低表达或下调，且其表达水平与肿瘤的分化程度呈正相关，即肿瘤分化越差，表达越低。从而表明p16的低表达可能对CSCC的进展有重要意义。

本实验还研究了p53及p16在BD和CSCC中表达的相关性，结果显示p53及p16在BD中表达均上调，二者在BD中的表达呈正相关性（rs=0.402，P＜0.05）；p53在 CSCC 中表达上调，p16在 CSCC 中表达下调，二者在CSCC的表达呈负相关性（rs=-0.579，P＜0.001）。在正常皮肤中，p53能够快速修复紫外线和致癌刺激物损伤的基因，p16通过抑制周期素依赖性激酶参与抑制细胞周期，故能抑制肿瘤的发生。p53基因突变及p16功能丧失可导致皮肤肿瘤的发生。在BD中，二者的表达呈现均质性，发挥共同的作用。在CSCC中，二者的表达呈现异质性，而据文献报道p16在皮肤癌中的表达差异性较大，可能还有其他机制参与，但其具体机制尚不明确。Blokx等[13]关于p53和p16在肾移植和免疫功能正常表皮癌中的研究显示，p53及p16在皮肤癌的发生中呈均质性。本文实验结果与Blokx等[13]结果不一致。有待进一步研究。

综述所述，p53及p16的高表达可能在BD的发生中起重要作用，且p53的高表达可能在CSCC的发生、发展及浸润中同样发挥着重要作用，p16的低表达可能对CSCC的进展有重要意义。但在CSCC中，p16的表达尚存在争议，其表达的高低可能与皮肤癌是否发生在曝光部位有关，有待进一步研究。