反相高效液相色谱法测定恩施不同产地刺五加中紫丁香苷和异嗪皮啶含量

2019-09-30袁丽君李姣张雪李三宇于啊香涂星

中国中医药信息杂志 2019年9期

袁丽君　李姣　张雪　李三宇　于啊香　涂星

摘要：目的考察恩施不同產地刺五加中紫丁香苷和异嗪皮啶的含量，为恩施地区刺五加的开发和利用提供依据。方法采用Inertsustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长分别为266、344 nm。结果紫丁香苷和异嗪皮啶分别在2.5～100 μg/mL、5～500 μg/mL范围内呈良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性试验RSD<2.30%，紫丁香苷、异嗪皮啶的加样回收率分别为100.60%、97.77%，RSD分别为1.82%、2.50%。宣恩县椿木营、利川市南坪镇、建始县官店镇、建始县高坪镇、恩施市红土乡、鹤峰县燕子乡所产的刺五加中紫丁香苷平均含量分别为0.191%、0.225%、0.224%、0.278%、0.289%、0.239%，异嗪皮啶平均含量分别为0.018%、0.016%、0.016%、0.020%、0.009%、0.013%。结论恩施地区所产刺五加中紫丁香苷含量较高，可作为紫丁香苷的重要来源。

关键词：刺五加;紫丁香苷;异嗪皮啶;反相高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）09-0085-04

Content Determination of Syringing and Isofraxidin in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis from Different Producing Areas of Enshi by RP-HPLC

YUAN Lijun¹， LI Jiao²， ZHANG Xue²， LI Sanyu¹， YU Axiang¹， TU Xing^1，3

1. Department of Medicine， Hubei Minzu University， Enshi 445000， China; 2. College of Science and Technology， Hubei Minzu University， Enshi 445000， China; 3. Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases， Enshi 445000， China

Abstract： Objective To investigate the content of syringing and isofraxidin in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis from different producing areas of Enshi; To provide references for its development and utilization. Methods Separation was carried out by Inertsustain C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）. Mobile phase consisted of methanol-water （25：75）; the flow rate was 1.0 mL/min; column temperature was set as 30 ℃; sample volume was 10 μL; the detection wavelengths were set at 266 nm and 344 nm. Results A good liner correlation of syringing and isofraxidin was obtained over the range of 2.5–100 μg/mL and 5–500 μg/mL， respectively. RSD value of precision， stability and repeatability were all under 2.30%. The recovery rates of syringing and isofraxidin were 100.60% and 97.77%， RSD were 1.82% and 2.50%， respectively. The average contents of syringing were 0.191%， 0.225%， 0.224%， 0.278%， 0.289% and 0.239% in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis originated in Chun-muying Town， Nanping Town， Guandian Town， Gaoping Town， Hongtu Town and Yanzi Town， respectively. The average contents of isofraxidin were 0.018%， 0.016%， 0.016%， 0.020%， 0.009% and 0.013%， respectively. Conclusion Content of syringing in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis from Enshi area is high， which can be the important source of syringing.

Keywords： Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis; syringing; isofraxidin; RP-HPLC

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Ru-pr. et Maxim.）Harms的干燥根及根茎或茎，味辛、微苦、性温、无毒，具有益气健脾、补肾安神、固本益智功效，主治腰膝酸软、体虚乏力、失眠、多梦、食欲不振等症^[1-3]。现代研究表明，刺五加主要含有苷类（如紫丁香苷、紫丁香树脂苷）及多种木质素类、异嗪皮啶和黄酮类等活性成分^[4-5]。异嗪皮啶具有镇静、抗肿瘤及抗氧化作用，而紫丁香苷具有抗肿瘤、保护肝缺血损伤的作用^[6-9]。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）以异嗪皮啶为定性指标、紫丁香苷为定量指标，对刺五加进行质量控制^[1]。

刺五加主要生长于东北地区，以黑龙江省产量最大，在吉林、辽宁、河北等地也有分布。恩施地区地处北纬30°，素有华中药库的美誉，其下属八县市均有刺五加分布。本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定恩施不同地区所产刺五加中紫丁香苷和异嗪皮啶含量，为刺五加药用资源的保护、开发和利用提供参考。

1 仪器与试药

LC-2030C液相色谱仪（日本岛津），VS-100UE型恒温超声提取仪（无锡沃信仪器制造有限公司），BT-25S型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯）。

紫丁香苷对照品（纯度≥95.0%，HPLC级，批号111574-200603）、异嗪皮啶对照品（纯度≥99.9%，HPLC级，批号0837-200203），中国食品药品检定研究院;甲醇（HPLC级），美国默克公司;水为去离子超纯水;其他试剂均为分析纯。刺五加样品采集于恩施州不同地区，经湖北民族大学医学部朱敏英副教授鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Ru-pr. et Maxim.）Harms的干燥根及根茎，每个产地采集3批次，来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

分别取紫丁香苷和异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含紫丁香苷和异嗪皮啶500 μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备

精密称取刺五加粗粉1.0 g，置干净的具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，40 ℃超声（功率300 W，频率50 kHz）处理60 min，室温放凉后，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，精密移取续滤液1 mL，加50%甲醇定容至10 mL。

2.3 色谱条件及系统适用性

采用Inertsustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长为265 nm（紫丁香苷）、344 nm（异嗪皮啶），流动相为甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。

在上述色谱条件下，取紫丁香苷、异嗪皮啶对照品溶液和供试品溶液（恩施市红土乡）分别进样，色谱图见图1。结果紫丁香苷的保留时间约为4.6 min，异嗪皮啶的保留时间约为13.8 min，表明系统适用性良好。

2.4 线性关系考察

分别取紫丁香苷和异嗪皮啶对照品溶液，稀释为系列浓度的溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。以对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。紫丁香苷的回归方程为Y=24 693.777 6X-217 342.556 1，r=0.999 3;异嗪皮啶的回归方程为Y=81 153.720 7X-259 912.667 7，r=0.997 9。结果表明，紫丁香苷和异嗪皮啶分别在2.5～100 μg/mL、5～500 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

取紫丁香苷（15 μg/mL）和异嗪皮啶（25 μg/mL）对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，重复进样6次，以峰面积计算精密度RSD，结果紫丁香苷和异嗪皮啶的精密度RSD分别为1.90%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取恩施市红土乡刺五加样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h各进样1次，测定其峰面积，计算RSD。结果紫丁香苷和异嗪皮啶的RSD分别为1.52%、1.91%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

分别精密称取恩施市红土乡刺五加样品6份，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算峰面积RSD。结果紫丁香苷和异嗪皮啶的RSD分别为1.72%、1.48%，表明所建立的方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取恩施市红土乡刺五加樣品6份，每份各1 g，分别加入500 μg/mL的紫丁香苷对照品溶液和25 μg/mL的异嗪皮啶对照品溶液4 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率和RSD，结果表明紫丁香苷和异嗪皮啶的回收率良好，见表2。

2.9 含量测定结果

取6个产地不同批次刺五加样品，分别制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算紫丁香苷和异嗪皮啶的含量，结果见表3。

3 讨论

本研究参考文献[10-14]，分别选择流动相为乙腈-0.1%磷酸（20∶80）、甲醇-0.05%磷酸（20∶80）、甲醇-0.02%醋酸（30∶70）、乙腈-水（20∶80）、甲醇-水（20∶80）进行考察，结果发现以乙腈-0.1%磷酸（20∶80）、乙腈-水（20∶80）、甲醇-水（20∶80）为流动相均能较好实现紫丁香苷和异嗪皮啶的分离。综合考虑检验成本等，最终选择流动相为甲醇-水（20∶80）。

本研究采用的PAD检测器可实现同步分析，经等高线和纯度分析确定成分后，紫丁香苷的最大吸收波长为266 nm，异嗪皮啶的最大吸收波长为344 nm，与文献[15]报道一致。

本研究考察了超声提取、回流提取2种方法对提取效率的影响，结果发现二者无明显差异，故选择操作相对简单的超声提取法。本试验考察了甲醇、50%甲醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇作为溶剂对提取效率的影响，结果50%甲醇>75%乙醇>50%乙醇>甲醇>乙醇，故選择50%甲醇作为提取溶剂;考察了超声时间和溶剂用量对提取效率的影响，结果发现超声提取时间为60 min、溶剂用量为25倍效果最佳。

本研究测定结果表明，恩施地区6个产地18批次刺五加中紫丁香苷的含量均达到药典规定，甚至高达5～6倍，就该成分而言具有较高的开发利用价值。本研究建立的紫丁香苷和异嗪皮啶同步测定方法可操作性强、简便快捷、重复性好、回收率高，可更全面地评价刺五加的药材质量，可为刺五加的质量控制提供参考和借鉴。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：206.

[2] 侯雅竹，李志君，毛静远，等.中药刺五加心血管药理研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15（20）：2546-2549.

[3] 董文婷，霍金海，张海燕，等.刺五加叶的药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（23）：220-223.

[4] 周蕾，王梦楠，朱霄，等.刺五加对中枢神经系统的活性成分、药理作用及临床应用[J].湖南中医药大学学报，2018，38（8）：961-964.

[5] 张羡媛，李贺然.刺五加根的抗炎活性成分研究[J].中国医药导报， 2016，13（13）：20-23.

[6] 康施瑶，李廷利.异嗪皮啶镇静催眠作用的研究[J].中医药学报，2016， 44（6）：30-32.

[7] 汪琢，姜守刚，郭晓帆，等.刺五加中异嗪皮啶提取工艺优化及其抗肿瘤、抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发，2015，27（6）：1092-1098.

[8] 汪琢，姜守刚，祖元刚，等.刺五加中紫丁香苷的提取分离及抗肿瘤作用研究[J].时珍国医国药，2010，21（3）：752-753.

[9] 姜月红，王燕颖.紫丁香苷对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的初步研究[J].中国实验诊断学，2016，20（3）：359-361.

[10] 尚海花，王淼，刘颖，等.HPLC法测定不同产地刺五加中原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E和异嗪皮啶[J].现代药物与临床，2018， 33（6）：1324-1328.