枳实黄酮对照提取物研究及其在枳实药材质量控制中的应用

杨丽丽　姜艳艳　蒋丽娟　张薇　张永文　刘斌

摘要：目的  建立枳實黄酮对照提取物制备方法及定量方法，并探索其在枳实药材质量控制中应用的可行性。方法  采用溶剂提取法、色谱分离方法制备枳实黄酮对照提取物，以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品为对照，对枳实黄酮对照提取物含量进行标定。分别以已知含量的枳实黄酮对照提取物和单体成分对照品（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）为对照，建立枳实药材HPLC含量测定方法，并测定枳实药材中4种成分的含量，采用t检验和相关性分析对含量测定结果进行统计分析。结果  以枳实黄酮对照提取物为对照，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷进样量在各自范围内与峰面积呈良好的线性关系（r>0.999 6），平均回收率为100.45%～101.27%。t检验结果显示，2种方法测定的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量P值分别为0.97、0.38、0.69、0.84;相关性分析显示，2种方法测定结果的相关系数均在0.95以上，表明2种方法无明显差异。结论  枳实黄酮对照提取物可用于枳实药材的质量控制，本研究为枳实药材的质量控制与评价提供了新方法。

关键词：枳实;对照提取物;黄酮;质量控制

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0073-07

Study on Flavonoids Reference Extracts and Its Application to Quality Control of Aurantii Fructus Immaturus

YANG Lili¹， JIANG Yanyan¹， JIANG Lijuan¹， ZHANG Wei¹， ZHANG Yongwen²， LIU Bin¹

1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China; 2. Center for Drug Evaluation， National Medical Products Administration， Beijing 100022， China

Abstract： Objective To establish preparation method and quantitative method of flavonoids reference extracts （FRE）; To explore the feasibility of its application to quality control of Aurantii Fructus Immaturus. Methods The FRE of Aurantii Fructus Immaturus was prepared by solvent extraction and chromatographic separation techniques. Narirutin， naringin， hesperidin and neohesperidin were set as references to calibrate the contents of FRE of Aurantii Fructus Immaturus. Setting the known contents of FRE of Aurantii Fructus Immaturus and single components （Narirutin， naringin， hesperidin and neohesperidin） as references， HPLC methods for Aurantii Fructus Immaturus were established to detect the four components in Aurantii Fructus Immaturus. The results of the content determination were statistically analyzed by t-test and correlation analysis. Results Setting the reference extracts as references， Narirutin， naringin， hesperidin and neohesperidin were in a good linear relationship （r>0.999 6） within each range， and the average recovery rate was 100.45% to 101.27%. The t-test results showed that the P values of two determination methods of narirutin， naringin， hesperidin and neohesperidin were 0.97， 0.38， 0.69 and 0.84， respectively， and the correlation analysis showed that the correlation coefficients were all above 0.95， indicating that there was no significant difference between the two methods. Conclusion The FRE can be used in the quality control of Aurantii Fructus Immaturus. This study provides a new method for quality control and evaluation of Aurantii Fructus Immaturus.

Keywords：Aurantii Fructus Immaturus; control extracts; flavonoids; quality control

中药具有多成分、多靶点作用特点，多成分质量控制模式已成为中药质量控制的主要趋势和重要研究方向。中药常用的多成分质量控制模式基本采用以多种单一对照品作为对照物质进行中药质量评价，而多种单一对照品的模式由于存在化学对照品分离难度大、生产成本及技术要求高、检测成本昂贵等问题，在实际应用中受到诸多限制^[1]。为解决上述问题，有研究者提出运用一测多评法开展中药质量控制，但该方法在相对校正因子的定量、指标成分的色谱峰定性，以及方法的适用性和耐用性等方面尚存在一些问题^[2-3]。因此，建立一种适合多成分中药质量控制的方法是解决中药质量控制问题的有效途径之一，而运用中药对照提取物对中药进行质量控制，可以在解决对照品稀缺、多成分同时定量困难等问题方面有较大改善^[4-6]。

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破气消积、化痰散痞功效，主要用于治疗积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重等病症^[7]。枳实中含有黄酮、生物碱和挥发油等化学成分，其中，黄酮类成分含量约为22.45%～33.76%，具有抗炎^[8]、抗氧化^[9]、抑制癌细胞^[10]和抗过敏^[11]等药理作用，为其发挥药效作用的主要有效成分。枳实黄酮类成分主要由芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等组成^[12-14]。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）枳实含量测定项下仅以70%乙醇浸出物和辛弗林含量为指标进行质量控制^[7]，该评价方法可以在一定程度上控制和评价枳实的质量，但缺少黄酮类成分这一重要有效成分类型。为完善枳实的质量控制体系，本试验选取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为指标，制备枳实黄酮对照提取物，并对上述4种成分的含量进行标定，从而将枳实黄酮对照提取物应用于枳实药材的质量控制。

1  仪器与试药

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;KQ-500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Waters高效液相色谱仪（包括1525型二元高压梯度泵系统、2998型DAD检测器、2414型柱温控制系统、2707型自动进样系统、Breeze色谱工作站），美国Waters公司;稳定性试验箱（SHH-GSD），重庆永生实验仪器厂;Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;Sartorious BT 25S型十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

芸香柚皮苷对照品（批号MUST-17030408，纯度99.20%）、柚皮苷对照品（批号MUST-17040102，纯度98.28%）、新橙皮苷对照品（批号MUST-17040707，纯度98.79%），成都曼斯特生物科技有限公司;橙皮苷对照品（批号721-860110，纯度98.08%），中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯，Fisher公司），屈臣氏纯净水，其他试剂均为分析纯。21批枳实药材分别购自不同地区，经北京中医药大学刘元艳教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Cirtus sinensis Osbeck的干燥幼果，来源信息见表1。

2  方法与结果

2.1  枳实黄酮对照提取物研究

2.1.1  对照提取物制备

取枳实药材（S21），适当破碎（绿豆大），用8倍量70%乙醇（含0.5%氨水）回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，即得提取物浸膏。提取物浸膏加10倍量水超声（功率100 W，频率40 kHz）分散30 min，3000 r/min离心30 min。残渣部分冷冻干燥;上清液以0.5 BV/h吸附流速通过AB-8大孔吸附树脂柱，以1 BV/h洗脱流速，依次用水洗脱5 BV、40%乙醇洗脱4 BV，收集40%乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得40%乙醇洗脫部位。残渣与40%乙醇洗脱部位合并，即得枳实黄酮对照提取物。

2.1.2  对照提取物标定

2.1.2.1  色谱条件

采用Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-乙酸（38∶58∶4），流速1 mL/min，检测波长283 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。混合对照品和对照提取物色谱图见图1。

2.1.2.2  对照品溶液制备

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芸香柚皮苷20.64 μg、柚皮苷20.59 μg、橙皮苷21.44 μg、新橙皮苷20.72 μg的溶液。

2.1.2.3  供试品溶液制备